不同认知障碍大鼠模型造模效果比较

李肇蕤 李孟知 程子娟 曹 娜 刘漫君 朱 琳 夏春波

1.桂林医学院基础医学院人体解剖学教研室，广西桂林 541004；2.桂林医学院附属医院新生儿科，广西桂林 541001；3.桂林医学院附属医院病理科，广西桂林 541001

阿 尔兹海默 病（Alzheimer's disease，AD）是一种复杂的神经系统退行性疾病，通常会导致包括学习和记忆在内的认知功能的严重损害，全球受到其影响的人超过4000 万，并且预计未来几十年内会呈指数级增长，但其发病机制尚未完全清楚[1-3]。为开展AD 相关研究，众多学者尝试了各种模式生物，目前虽已有多种认知障碍动物模型造模方法[4-6]，但各有优缺点。选择合适的认知障碍动物模型是AD 实验研究的重要组成部分，为此本研究利用Morris 水迷宫系统对三种不同认知障碍大鼠模型的造模效果进行比较，为认知障碍动物研究提供更客观、可靠的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

45 只健康成年雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠，体重200～300 g，均由桂林医学院SPF级动物实验中心提供，合格证号：SCXK 桂2007-0001。在实验开始前运用Morris 水迷宫系统进行筛选，剔除游泳障碍、原地旋转与静止不动的大鼠后剩余40 只，随机将其分为柠檬酸铝组、亚硝酸钠组、钠铝联合注射组与对照组，每组各10 只。环境温度为22～26 ℃，自然昼夜节律。大鼠自由进食、饮水，所有实验均符合动物伦理标准，获得桂林医学院实验动物伦理委员会批准。

1.2 主要试剂与设备

柠檬酸铝、亚硝酸钠均购自源叶生物科技有限公司，Morris 水迷宫系统（XR-XM101，上海欣软）。

1.3 认知障碍模型建立

各组大鼠称量体重后，柠檬酸铝组腹腔注射5% 柠檬酸铝水溶液，剂量为120 mg/kg。亚硝酸钠组腹腔注射3% 亚硝酸钠水溶液，剂量为30 mg/kg。钠铝联合注射组以相同的剂量同时腹腔注射以上两种试剂。以上三组均隔天给药，共持续60 d，并随体重变化调整药物注射量。对照组未施加任何干扰因素，各组大鼠给予充足的食物与水。

1.4 认知障碍模型学习记忆能力评价

给药60 d 后利用Morris 水迷宫进行学习记忆能力检测。定位航行实验：实验共持续4 d，每天进行4 次，每次间隔3 min。透明逃生平台被放置在圆形游泳池第四象限水下，记录大鼠分别从4 个象限入水点入水到爬上平台所需的时间（逃避潜伏期），若大鼠120 s 内没有爬上平台，则将逃避潜伏期记录为120 s 并将大鼠置于平台上停留15 s 以熟悉位置，计算每天平均逃避潜伏期。空间探索实验：于定位航行实验结束后第5 天进行。在此实验中撤去逃生平台，大鼠于原平台所在象限的对侧象限入水，记录120 s 内大鼠跨越原平台所在位置的次数。平均逃避潜伏期、跨越原平台所在位置的次数两项指标与对照组比较差异均有统计学意义，则判定为学习记忆功能障碍。

表1 定位航行实验中各组大鼠平均逃避潜伏期（，s）

表1 定位航行实验中各组大鼠平均逃避潜伏期（，s）

注：与对照组比较，*LSD-t=5.195，*P ＜0.05；#LSD-t=3.998，#P ＜0.05

1.5 统计学分析

应用SPSS 22.0 统计学软件与Graphpad Prism 8.0 软件对实验结果进行分析作图。计量资料以（）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析（ANOVA），进一步两两比较运用LSD-t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 定位航行实验结果

随着实验天数的增加，各组大鼠逃避潜伏期逐渐缩短。第3 天起，与对照组比较，钠铝联合注射组大鼠平均逃避潜伏期显著延长，差异有统计学意义（P＜0.05），柠檬酸铝组与亚硝酸钠组平均逃避潜伏期与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示柠檬酸铝组与亚硝酸钠组大鼠仍有较强的学习获取能力，而钠铝联合注射组大鼠学习获取能力较差。见表1、图1～2。

2.2 空间探索实验结果

与对照组比较，钠铝联合注射组大鼠跨越原平台位置次数显著减少，差异有统计学意义（P＜0.05），柠檬酸铝组和亚硝酸钠组跨越原平台位置次数与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示柠檬酸铝组大鼠与亚硝酸钠组大鼠空间记忆能力未有明显改变，而钠铝联合注射组大鼠空间记忆能力减弱。见表2、图1～2。

表2 空间探索实验各组大鼠跨越平台次数（，次）

表2 空间探索实验各组大鼠跨越平台次数（，次）

注：与对照组比较，*LSD-t=3.211，*P ＜0.05

图1 各组大鼠Morris 水迷宫实验结果

图2 各组大鼠Morris 水迷宫游泳轨迹

3 讨论

海马作为中枢边缘系统的一部分，其结构与学习记忆功能密切相关，AD 早期最主要的表现是学习记忆能力的下降[7-8]。Morris 水迷宫是评价动物学习记忆的经典方法，在AD 动物模型的研究领域中被广泛运用[9-10]。大鼠与一般动物相比，具有繁殖能力强、生存率高、易于饲养等优点，有利于进行大样本的实验研究，同时又具有较强的快速学习能力，是目前最广泛用于AD 模型制备的动物[11-13]。

本实验通过腹腔注射相应试剂的方式建立认知障碍大鼠模型，结果显示，与对照组比较，钠铝联合注射组大鼠逃避潜伏期时间延长、跨越平台次数减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。单纯注射柠檬酸铝或亚硝酸钠组的大鼠逃避潜伏期、跨越平台次数与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。人体的生长及大脑发育都离不开金属元素的作用[14]，金属离子长期处于异常水平时可导致大脑缺氧从而导致严重的脑外伤[15-17]。研究表明，金属铝与认知障碍发生关系最为密切，铝导致的学习与记忆能力下降主要与线粒体、内质网损伤和多种蛋白功能障碍有关[18-20]。亚硝酸钠会导致脑缺氧、神经递质浓度失衡以及神经元坏死[21-23]。本实验柠檬酸铝与亚硝酸钠联合注射取得了良好的造模效果，推测可能与钠铝联合作用导致的脑内神经递质浓度失衡、海马组织功能受损有关。

综上所述，大鼠腹腔联合注射柠檬酸铝和亚硝酸钠的造模方法较好的模拟了AD 的病理改变，结果显示大鼠有明显的学习记忆功能障碍，造模效果优于单独腹腔注射柠檬酸铝或亚硝酸钠，操作简便，可重复性强，是较为理想的认知障碍大鼠模型。