HPLC法测定不同产地醋莪术饮片中姜黄素、双去甲氧基姜黄素和去甲氧基姜黄素的含量

高红宁 殷 奕 毛春芹 陆兔林

1.南京中医药大学药学院，江苏南京 210046；2.南京多康商贸有限公司，江苏南京 210000

中药莪术为姜科植物温郁金C.wenyujin Y.H.Chen et C.Ling、广西莪术C.kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang和蓬莪术C.phaeocaulis Valeton的干燥根茎，味辛、苦，性温，归肝、脾经，具有消积止痛、行气破血的功效[1]。莪术主要有效成分为挥发油和姜黄素类[2-11]。其中姜黄素类成分主要为姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素。姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素具有明显的体外抗凝血与抗血栓的活性[12-16]。在中医临床上应用较多的是醋莪术饮片，但有关醋莪术饮片的研究报道较少；本实验首次对醋莪术饮片中姜黄素、双去甲氧基姜黄素和去甲氧基姜黄素的含量进行同时测定，能更好地控制醋莪术饮片质量，可为制定醋莪术饮片质标提供技术手段。

1 材料

1.1 仪器

1100 型HPLC 仪（美国安捷伦公司）；KH-300DB 型超声清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；Mettler AG285 电子分析天平 （瑞士梅特勒-托利多集团）；FA210N 电子天平（上饶市鸿翔实业有限公司）；40-B型高速万能粉碎机（常州迈顺机械有限公司）。

1.2 试药

姜黄素对照品（DST180111-014）；去甲氧基姜黄素对照品（DST181220-030）；双去甲氧基姜黄素对照品（DST181220-021）；以上对照品均购自成都德斯特生物技术有限公司。莪术样品购自我国广西省、浙江省、四川省，经南京中医药大学药学院潘金火教授鉴定为姜科植物温郁金C.wenyujin Y.H.Chen et C.Ling、广西莪术C.kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang和蓬莪术C.phaeocaulis Valeton的 干燥根茎。取各产地莪术样品按《中华人民共和国药典》2015年版[1]莪术项下自制得醋莪术饮片。表1 为莪术样品批号、产地和来源。甲酸、乙腈为色谱纯（美国Fish 公司），其他溶剂均为分析纯。

表1 莪术批号产地和来源

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent pro shell C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相： 0.5‰甲酸水（A）-0.5‰甲酸乙腈（B），梯度洗脱：0～10 min，65%～55%A；10～20 min，55%～30%A；20～25 min，30%～5%A；25～30 min，5%A；30～35 min，5%～60%A；35～40 min，60%A；流速：1.0 ml/min；进样量：10 μl；检测波长：415 nm；柱温：30℃。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的配制 取3 种对照品适量，精密称定，置于同一5 ml 量瓶中，加甲醇溶解定容，制得含姜黄素0.071 mg/ml、去甲氧基姜黄素0.051 mg/ml、双去甲氧基姜黄素0.011 mg/ml 的混合对照品贮备液。

2.2.2 供试品溶液的配制 精密称定0.5 g 醋莪术饮片粉末，置于50 ml 量瓶中，加入20 ml 70%乙醇，称定质量，超声提取30 min，补足减失质量，用微孔滤膜（孔径为0.45 μm）过滤，所得的滤液作为供试品溶液。

2.3 专属性试验

取供试品溶液、混合对照品贮备液，按上述色谱条件测定进样，记录色谱，详见图1，由图1 可知，姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素分离良好，在各出峰处均无干扰，表明该方法的专属性良好。

图1 高效液相色谱图

2.4 标准曲线及线性范围

精密吸取混合对照品贮备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.5 ml，分别置于5 ml 量瓶内，加甲醇稀释至刻度，分别精密吸取10 μl 注入HPLC 仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积。以峰面积积分值（Y）为纵坐标，对照品质量浓度（X）为横坐标，进行线性回归，得到各对照品线性方程、相关系数及线性范围见表2。

表2 对照品的标准曲线、相关系数及线性范围

2.5 精密度试验

精密吸取对照品溶液按上述色谱条件，于1 d连续进样，记录峰面积。结果显示姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素的峰面积RSD值分别为0.61%、1.13%、0.94%。

2.6 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h 时，按上述色谱条件进行测定，记录峰面积。结果姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素峰面积的RSD 分别为0.3%、0.8%、0.6%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.7 重复性试验

取批号为SC180211 的醋莪术饮片粉末0.5 g，共6 份，精密称定，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按上述色谱条件进样测定，记录峰面积，计算姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素的RSD 值，结果分别为1.0%、1.8%、1.0%。

2.8 加样回收率试验

取批号为SC180211 的醋莪术饮片粉末0.25 g，精密称定，共9 份，置于具塞锥形瓶中，分别加入低、中、高3 个质量浓度的混合对照品溶液0.8、1.0、1.2 ml，按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，进样测定，计算加样回收率。结果姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素的平均回收率分别为99.2%、97.7%、96.9%，RSD 分别为1.0%、1.2%、1.9%。

2.9 样品含量测定

取不同产地的醋莪术饮片适量，粉碎，过三号筛，取粉末0.5 g，精密称定，按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，再按上述色谱条件进样测定3 种成分的量，结果见表3。

表3 不同产地醋莪术中各成分的含量测定结果（n=3）

3 讨论

3.1 色谱柱选择

本实验考察了Agilent pro shell C18色谱柱和Kromasi C18色谱柱，发现采用Agilent pro shell C18色谱柱，3 种成分均能出峰，各峰间分离度、对称性好，分离效果为佳。

3.2 色谱条件选择

本研究依次考察了乙腈-水、乙腈-甲酸水、甲酸乙腈-甲酸水，结果表明0.5‰甲酸水（A）-0.5‰甲酸乙腈（B），0～10 min，65%～55A；10～20 min，55%～30%A；20～25 min，30～5%A；25～30 min，5%A；30～35 min，5%～60%A；35～40 min，60%A；流速1.0 ml/min；柱温30℃；检测波长415 nm时分离效果最佳。

3.3 提取条件选择

在选择供试品提取方法时，考察了乙醇回流提取法和乙醇超声提取法，发现两者的提取效率接近，但乙醇超声提取节省时间，操作简便，故选择乙醇超声提取法。在乙醇超声提取的基础上，分别考察50%、60%、70%、80%乙醇不同提取溶剂；30、40、50、60 min 不同提取时间；25、40、55、70 倍量液料比，确定最佳提取方法为70%乙醇40 倍量超声提取30 min。

表3 结果表明，不同产地醋莪术中姜黄素、双去甲氧基姜黄素和去甲氧基姜黄素的含量存在差异，总体上四川产醋莪术中姜黄素、双去甲氧基姜黄素和去甲氧基姜黄素含量较高，浙江产醋莪术中未检出双去甲氧基姜黄素，姜黄素和去甲氧基姜黄素含量次之，而在广西产醋莪术中测不到姜黄素、双去甲氧基姜黄素和去甲氧基姜黄素含量。同产地不同时期醋莪术中姜黄素、双去甲氧基姜黄素和去甲氧基姜黄素的含量也有差别，这可能与气候、光照、温度、降雨量及加工方法等因素有关，或由于本实验收集批次较少，样品存在差异所致。相关研究有待于进一步开展。

本研究建立了HPLC 法测定不同产地醋莪术饮片中姜黄素、双去甲氧基姜黄素和去甲氧基姜黄素的含量方法，确定以70%乙醇为提取液，40 倍量超声提取 30 min，色谱柱为Agilent pro shell C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.5‰甲酸水-0.5‰甲酸乙腈，梯度洗脱；流速1 ml/min；柱温30℃；检测波长415 nm；进样量10 μl。姜黄素、双去甲氧基姜黄素和去甲氧基姜黄素分别在1.42～71.00、0.22～10.82、1.01～50.50 μg/ml 时与色谱峰面积线性关系良好，平均回收率分别为99.2%、96.9%、97.7%，RSD 分别为1.0%、1.9%、1.2%，该方法准确、灵敏。

目前在中医临床上应用较多的是醋莪术饮片，但有关醋莪术饮片的研究报道较少，对莪术的研究多集中在生药、生饮片和挥发油方面，本实验采用HPLC 法梯度洗脱首次对醋莪术饮片中姜黄素、双去甲氧基姜黄素和去甲氧基姜黄素的含量进行同时测定，并对不同产地醋莪术中姜黄素、双去甲氧基姜黄素和去甲氧基姜黄素的含量进行比较，实验方法准确、快速、重复性好，可作为评价醋莪术中姜黄素、双去甲氧基姜黄素和去甲氧基姜黄素等成分的可靠分析方法，能更好地控制醋莪术饮片质量，旨在为制定醋莪术饮片质量标准提供理论依据。