不同部位缺血后适应对大鼠心肌缺血再灌注损伤氧化应激的影响

王 朝，安 健，李晓红，杜 叶

（1.山西医科大学，2.山西省心血管病医院心内科，山西 太原030001）

冠心病，尤其是心肌梗死是当今社会导致死亡的重要因素之一［1］，而闭塞冠状动脉的早期再通，可使面临坏死的心肌得以保存或使心肌坏死面积减小，但对心肌进行早期再灌注却常常伴随心肌收缩舒张功能下降、再灌注性心律失常发生、心肌能量代谢变化以及心肌结构的变化，即心肌缺血再灌注损 伤（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）［2］。减轻缺血再灌注损伤是减轻心梗损伤的重要环节，心肌缺血后适应是其中一种重要方法，可分为原位缺血后适应（local ischemic postcondi⁃tioning）及远端肢体缺血后适应（remote ischemic postconditioning）［3，4］，而 远 端 肢 体 缺 血 后 适 应 由 于其时机可预料、操作较简单，引起越来越多学者的关注［5，6］。本实验通过原位缺血后适应与远端肢体缺血后适应两种处理方式，比较氧化应激指标、心肌坏死面积、心功能的改变，为减缓心肌缺血再灌注损伤提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

SOD、MPO、XOD 测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）、大鼠肿瘤坏死因子-α 试剂盒（上海西唐生物科技有限公司）、CK-MB ELISA Kit（武汉华联科生物技术有限公司）、HX-101E 小动物呼吸机（成都泰盟有限公司）、心电图记录仪（BL-410 生物机能实验系统）、GEVIVID7 彩色多普勒超声仪（美国GE 公司）、酶标仪DENLEY DRAGON Wells⁃can MK 3（Thermo）、洗 板 机Wellwash 4 MK2（Thermo）、漩涡混合器XW-80A（上海青浦沪西仪器厂）、连续分液器（TOMOS LIFE SCIENCE Group）、高通量组织研磨器（宁波新芝）。

1.2 模型建立

健康SD 雄性大鼠32 只，重量220～250 g，由山西医科大学实验动物中心提供，研究经山西医科大学实验动物伦理委员会的批准。10% 水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔麻醉，连接心电图记录仪；颈部正中皮肤切开，气管插管接小动物呼吸机（潮气量7 mL、呼∶吸5∶4、呼吸频率60 次/min）；分离左胸部皮肤及肌肉组织，离断3、4 肋骨，眼睑撑开器撑开胸廓暴露心脏，跨越左心耳及肺动脉圆锥之间，接扎冠状动脉造成心肌缺血，成功标志为心电图ST 段抬高或心尖变白；缺血30 min 后恢复再灌注，再灌注标志为抬高ST 段下降一半以上［7］。

1.3 实验分组

（1）假手术（Sham）组：前降支穿线但不结扎；（2）缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）组：前降支结扎30 min，解剖双侧股动脉但不予夹闭，恢复再灌注3 h；（3）原位缺血后适应（local ischemic post⁃conditioning，LIPC）组：前降支结扎30 min，解剖双侧股动脉但不予夹闭，随后对前降支进行解除-结扎各30 s，共3 个循环，其后恢复前降支血流3 h；（4）远端肢体缺血后适应（remote ischemic postcondition⁃ing，RIPC）组：前降支结扎30 min，解剖双侧股动脉并对其解除-结扎各5 min，共3 个循环，其后恢复前降支血流3 h。

1.4 血清氧化应激指标以及CK-MB 的测定

造模完成后即刻经腹主动脉采血，离心机离心后将血清保存于−80℃冰箱，待造模工作完成后，将血清分别作如下检测：SOD（WST-1 法）、MPO（比色法）、XOD（比色法）按照试剂盒说明测定浓度，TNF-α、CK-MB 采用酶联免疫吸附剂测定法严格按照试剂盒说明测定浓度。

1.5 心肌梗死面积测定

腹主动脉采血后摘除心脏并冲洗，沿左心室长轴方向将心脏平均切为5 片，置于37℃2%TTC 溶液中孵育20 min，浸于多聚甲醛（4%）24 h 后取出，相机拍照，其中梗死区呈现白色，未梗死区呈现红色，采用Image-J 分析软件分析心梗面积百分比，心梗面积百分比=梗死区面积/总心肌面积。

1.6 大鼠心功能测定

应用GEVIVID7 多普勒超声仪检测各组大鼠的LVIDd、LVIDs、EF。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 血清氧化应激及炎症因子指标的比较

与Sham 组相比，I/R 组、LIPC 组、RIPC 组SOD明 显 减 小，XOD、MPO、TNF-α 明 显 增 大（P＜0.05）；与I/R 组相比，LIPC 组TNF-α 明显减小（P＜0.05），其余氧化应激指标无统计学差异；与I/R 组相 比，RIPC 组MPO、TNF-α 值 明 显 减 小（P＜0.05），SOD、XOD 无统计学差异；与LIPC 组相比，RIPC 组MPO 明显减小（P＜0.05），余各氧化应激指标无统计学差异。见表1。

表1 各组血清氧化应激及炎症因子指标结果（n=8，±s）Tab 1 Serum oxidative stress indicators and inflammatory factors results（n=8，±s）

表1 各组血清氧化应激及炎症因子指标结果（n=8，±s）Tab 1 Serum oxidative stress indicators and inflammatory factors results（n=8，±s）

注：与Sham 组相比，*P＜0.05；与I/R 组相比，#P＜0.05；与LIPC 组相比，&P＜0.05。

TNF-α(pg/mL)13.53±2.84 29.18±8.53*21.81±8.30*#21.31±7.54*#6.325 0.002组别Sham 组I/R 组LIPC 组RIPC 组FP SOD（U/mL）138.70±7.58 128.45±8.27*129.44±9.98*129.61±7.26*2.641 0.069 XOD（U/L）15.23±2.23 20.36±5.46*20.54±5.00*19.97±4.79*2.502 0.080 MPO（U/L）16.69±4.35 36.63±9.63*39.82±9.96*26.11±10.81*#&10.825＜0.001

2.2 心梗面积、CK-MB 的比较

与Sham 组相比，LIPC 组、RIPC 组、I/R 组心梗面积及CK-MB 明显增大（P＜0.05）；与I/R 组相比，LIPC 组、RIPC 组 心 梗 面 积 及CK-MB 无 统 计 学 差异（P＞0.05）；LIPC 组与RIPC 组间相比无统计学差异（P＞0.05）。见表2。

2.3 大鼠心功能指标比较

与Sham 组 相 比，LIPC 组、RIPC 组、I/R 组LVIDs 明显增加，EF 值明显减小（P＜0.05）；与I/R组相比，LIPC 组、RIPC 组左室容积及射血分数无统计学差异（P＞0.05），LIPC 组与RIPC 组间相比无统计学差异（P＞0.05）。见表3。

2.4 TTC 染色

心肌组织经TTC 染色后，梗死区呈现为白色，而非梗死区呈红色。图1 可见Sham 组心肌组织呈红色，未见明显白染区；I/R 组可见白色梗死区；LIPC 组、RIPC 组与其相比未见明显改善，见图1。

表2 各组心梗面积与CK-MB 结果（n=8，±s）Tab 2 Myocardial infarction area and CK-MB results（n=8，±s）

表2 各组心梗面积与CK-MB 结果（n=8，±s）Tab 2 Myocardial infarction area and CK-MB results（n=8，±s）

注：与Sham 组相比，*P＜0.05。

CK-MB(pg/mL）768.95±99.61 1 126.16±256.77*1 064.80±258.63*998.99±251.83*3.950 0.018组别Sham 组I/R 组LIPC 组RIPC 组FP心梗面积（%）6.88±1.55 17.00±4.04*14.40±5.03*15.04±5.15*8.942＜0.001

图1 各组心肌组织TTC 染色后形态Fig 1 The shape of myocardial tissue after TTC staining in each group

表3 各组大鼠心功能指标比较（n=8，±s）Tab 3 Cardiac function results（n=8，±s）

表3 各组大鼠心功能指标比较（n=8，±s）Tab 3 Cardiac function results（n=8，±s）

注：与Sham 组相比，*P＜0.05。

组别Sham 组I/R 组LIPC 组RIPC 组EF（%）85.75±6.63 67.13±5.91*69.00±8.18*65.50±8.18*10.825＜0.001 FP LVIDd（mm）4.99±0.54 5.17±0.28 5.28±0.49 5.39±0.49 1.081 0.373 LVIDs（mm）2.39±0.34 3.05±0.53*3.07±0.29*3.03±0.48*4.884 0.007

3 讨论

缺血再灌注损伤的发生由多个环节导致。梗死后心肌恢复再灌注，可使氧化应激反应增多，钙超载，线粒体膜通透性转换孔开放以及炎症损伤，其中氧化应激反应激活是导致心肌缺血再灌注损伤的主要机制之一［8-9］。本实验显示：各组氧化应激指标与Sham 组相比有统计学差异，提示心梗模型造 模 成 功。LIPC 组 与I/R 组 相 比TNF-α 明 显 减 小（P＜0.05），余各氧化应激指标无统计学差异，提示原位缺血后适应可一定程度减轻缺血再灌注损伤的氧化应激反应，分析结果产生的原因为：（1）样本量较小，结果代表性不强；（2）：反复的对前降支进行解除-结扎操作本身可能加重了心肌损伤，抵消缺血后适应带来的获益；（3）：可能原位缺血后适应对心肌缺血再灌注损伤的氧化应激反应改善不明显；与I/R 组相 比，RIPC 组MPO、TNF-α 值明显减小（P＜0.05），SOD、XOD 无统计学差异，提示远端肢体缺血后适应可一定程度减轻缺血再灌注损伤的氧化应激反应，分析结果产生的原因为：（1）远端肢体缺血后适应确可减轻缺血再灌注损伤的氧化应激反应，但由于本实验样本量较小，体现不明显；（2）可能远端肢体缺血后适应实施时间较短，并未对缺血再灌注损伤产生明显作用；与LIPC 组相比，RIPC 组MPO 明显减小（P＜0.05），可能与LIPC 组反复结扎冠状动脉加重心肌损伤有关，余各氧化应激指标无统计学差异，说明原位缺血后适应与远端肢体缺血后适应之间作用类似。

心肌缺血后适应可能减轻缺血再灌注损伤并已部分应用于临床，如急诊PCI 术中对梗死相关动脉短时间内通过球囊反复短暂阻断血流实施原位缺血后适应，急诊PCI 术前对远端组织通过血压计反复短暂阻断血流实施远端肢体缺血后适应，但新近临床研究表明他们对心梗患者的临床预后并未产生明显改善作用［10-14］。本研究显示与I/R 组相比，LIPC 组、RIPC 组的CK-MB、心梗面积虽然并没有产生统计学差异，但有减小的趋势，心功能指标LVIDd、LVIDs、EF 无统计学差异；LIPC 组与RIPC组相比较，结果无统计学差异，表明原位缺血后适应与远端肢体缺血后适应有减轻心肌损伤的趋势，这种趋势可能与他们减轻氧化应激反应有关。但可能由于改善作用有限，均未明显改善心功能，这与上述临床研究的结果相对应。

综上所述，原位缺血后适应与远端肢体缺血后适应虽然没有明显改善心功能，但有减小心肌损伤的趋势，这种作用可能与他们减少氧化应激反应有关。也与本实验样本量较小、缺血后适应处理时间较短等因素相关。也为缺血后适应应用于临床提出更多挑战。