食品中菌落总数、大肠菌群的检测技术探讨

◎ 范 蕊，王文文，卢 彬，曹雪琴

（新疆维吾尔自治区分析测试研究院，新疆 乌鲁木齐 830011）

菌落总数是食品的卫生指标之一，反应食品被细菌污染的程度及卫生质量。菌落总数的测定看似简单，但由于食品基质复杂，微生物受损伤程度不一，恢复能力不同，所需要的营养要素不同等，要在同等条件下把所有的细菌都培养出来，实属不易[1]。目前，我国食品微生物菌落总数的检测主要依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》（GB 4789.2—2016）、 《进出口食品中菌落总数计数方法》（SN/T 0168—2015）、 《出口饮料中菌落总数、大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌计数方法 疏水栅格滤膜法》（SN/T 1607—2017）以及《商品化试剂盒检测方法 菌落总数 方法一》（SN/T 4544.1—2016）。

国际上，美国AOAC 标准中关于菌落总数比较多，主要有《食品化妆品细菌总数螺旋平板法》（AOAC 977.27—1981）、《食品细菌总数滤膜法》（AOAC 986.32—1987）、《食品中细菌总数的Redigel 果胶法》（AOAC 988.18—1990）及《食品中细菌总数的检测 再水化干膜法》（AOAC 990.12—1994）；加拿大食药局采用的是《食品菌落总数3M 法》；英国菌落总数等同采用了ISO 4833—2013；我国的标准也是以ISO4833—2013 为基础，修订完成的。

大肠菌群是一群革兰氏阴性、杆状、无芽孢、兼性厌氧及能发酵乳糖产酸产气的肠道细菌的总称。它并非细菌分类学上的命名，也不代表某一种或某一属的细菌，而是卫生细菌领域用语，特指具有某些特性的一组和粪便污染有关的细菌。这一群细菌主要包括肠杆菌科的埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属（又叫产气肠杆菌属，包括阴沟肠杆菌和产期肠杆菌）、克雷伯氏菌属的一部分和沙门菌属的第Ⅲ亚属（能发酵乳糖）的细菌。它们在生化及血清学方面并非完全一致，但都来自粪便，且与肠道病原菌的生活能力接近，故可作为食品、饮水等被粪便污染的间接指标[2]。

大肠埃希氏菌是大肠菌群中的典型种，除大肠埃希氏菌外，大肠菌群的主要成员是产气肠杆菌和若干柠檬酸杆菌等。食品中粪便含量只要达到10-3mg·kg-1即可检出大肠菌群[3]。在具体鉴定时，一般规定产酸、产气的条件是37 ℃下48 h；美国标准规定产气的条件是35 ℃下48 h；英国的细菌学家进一步规定氧化酶为阴性，在胆盐或其他表面活性剂存在下能进行好氧或厌氧性生长；而英国乳品微生物学家则除上述要求外，还规定乳糖发酵的温度为30 ～35 ℃[4]。我国大肠菌群检测GB 4789.3—2016 是参考ISO 4832—2006 和BAM：Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria（2002）的内容修订完成，分为MPN 法和平板计数法。

1 试验材料

1.1 样品来源

样品来自中国工业微生物菌种保藏中心（CICC 质控样：FTQC-03-02 乳粉中的大肠菌群，FTQC-02-02 乳粉中的菌落总数）、中国检验检疫科学研究院（CAIQ质控样：QC-FD-004 乳粉中的大肠菌群，QC-FD-002 乳粉中的菌落总数）以及新疆维吾尔自治区市场监督管理局（能力验证样品：20-A030 乳粉中的菌落总数和大肠菌群，20-E690 乳粉中的菌落总数和大肠菌群）。

1.2 培养基及试剂

平板计数琼脂培养基（PCA）、结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）和月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST），均购自北京陆桥技术股份有限公司；氯化钠，购自天津市北联精细化学品开发有限公司；3MPetrifilmTM 试纸片，购自美国3M 公司。

1.3 试验仪器

IGS400 恒温培养箱（赛默飞世尔科技公司）、 LDZM-80KCS-2-01-00 立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）。

2 试验方法

2.1 样品处理方法

操作步骤：无菌开启西林瓶，立即（1 min 内）加入少量（2 ～4 mL）稀释液（可以用生理盐水或磷酸缓冲液）进行再水化，稀释液合计40 mL，待溶解后，吸出放入无菌瓶中，反复用余下的稀释液清洗西林瓶内壁，回收清洗液放入上述的无菌瓶中，此溶液即是待测样品原液（针对定量检测项目，该40 mL 液体即为待测原液，即100），再按照无菌操作稀释至10-6。全过程20 min 内完成。将上述制备的40 mL 待测原液按照标准方法GB 4789.2—2016 和GB 4789.3—2016 进行后续试验。

2.2 2 种不同来源的质控样对比

将CICC 和CAIQ 的质控样品，按GB 4789.2—2016 标准方法检测菌落总数，观察不同培养时间对两种质控样品菌落计数结果的影响。

2.3 2 种不同方法对能力验证样品中菌落总数的测定比较

将新疆维吾尔自治区市场监督管理局的能力验证样品，分别采用平板计数法和3M 试纸法测定菌落总数，每个样品做6 个平行，取平均值，同时用质控样作为参照。

2.4 3 种不同方法对能力验证样品中大肠菌群数的测定比较

将新疆维吾尔自治区市场监督管理局的能力验证样品，参照GB 4789.3—2016，分别采用MPN 法、平板计数法和3M 试纸法进行测定大肠菌群，每个样品做双平行试验，每组试验各设2 个空白对照，同时用质控样作为参照。

3 结果与分析

3.1 不同培养时间对菌落总数计数结果的影响

样品分别来自CICC 和CAIQ 质控样品，按 GB 4789.2-2016 标准方法检测，观察不同培养时间对两种质控样品菌落计数结果的区别，试验结果见表1。

表1 不同培养时间对菌落总数计数结果的影响表 （单位：CFU·g-1）

如表1 结果所示，CICC 的样品培养24 h 和培养48 h 计数结果差别不大，24 h 时有少量的菌落较小，计数时可能会有遗漏，造成结果偏小。CAIQ 的样品培养24 h 计数结果与标准值差别不大，培养48 h 后由于平板上有大量的片状菌，直径为1 ～2 cm，大量的片状菌将24 h可以明显观察到的菌落形态较小的菌（直径为0.5 ～1 mm）全部覆盖，基本不能计数[5]。我国国家标准规定，除水产品外，菌落总数的计数时间为48 h，不同的样品培养时间不能一概而论，培养24 h时应对菌落先进行一次预计数，培养48 h 时再对其进行一次计数，若48 h 计数时没有片状菌落的计数干扰以48 h 计数结果为准。若48 h 时菌落形态依然很小，肉眼难以计数，说明样品中的菌落有可能属于休眠或受损状态，应延长培养时间至72 h 再计数。

3.2 菌落总数两种检测方法的对比

如表2 所示，使用3M 试纸检测结果值总体上要比使用平板计数法得到的值低，但结果值与质控值接近，说明3M 试纸用于食品的快速检测检验结果比较可靠。

表2 菌落总数2 种检测方法的对比表（单位：CFU·g-1）

3.3 大肠菌群3 种检测方法的对比

样品为来自新疆维吾尔自治区市场监督管理局的能力验证样品，试验空白对照大肠菌群数均为零，检测结果见表3。

表3 大肠菌群3 种检测方法的对比表

如表3 所示，3 种检测方法对比之后，MPN 法结果值与质控标准值接近，说明MPN 法选择性高，与平板计数法之间无明显差异，相比较而言，3M 试纸片法方便快捷，可在检测实验中作为对照或参考。

4 结论与讨论

菌落总数在进行能力验证时，应充分考虑样品中可能会添加的蔓延菌和生长迟缓细菌，因此在培养时间和观察上应该注意，必要的时候加入三苯基氯化四氮唑（TTC），或覆盖一层培养基来有效抑制菌体蔓延[6]。培养基中若要加TTC，计数平板不得超过 300 CFU·g-1，否则平板上的菌落会呈色减弱或不呈色[7]。有时为了区分样品和菌落可采用冷培养平板作为对照。另外，培养基倾注的温度与厚度是实验正确与否的关键，温度过高会造成已受损伤的菌细胞死亡，若培养基太薄，在培养过程中可能因水分蒸发而影响细菌的生长。应注意每递增稀释一次，必须另换一支吸管，以保证样品稀释倍数的准确性。

大肠菌群MPN 法初发酵实验，对于产酸未产气的发酵管，可以用手轻轻拍打试管，如果有气泡沿着管壁上升，应考虑可能有气体产生。这种情况在初发酵时，容易产生，此时可能会受到试管内小倒管管口完整性、小倒管外是否有沉渣等影响，应进一步做验证实验[8]。大肠菌群中典型菌落主要包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌，建议检验人员初次实验时取这4 种细菌进行阳性对照试验，注意观察并记录典型大肠菌群形态，区分出典型菌落和可疑菌落。

此外，在菌落总数和大肠菌群计数时，还可能出现高稀释倍数培养皿细菌数与低稀释倍不成10 倍关系，或高稀释倍数培养皿细菌数高于低稀释倍数[9-10]，这可能是检验过程操作有误或者样品中还含有防腐剂，此时的计数结果不应作为检测报告的依据。