热暴露后大鼠食管紧密连接蛋白表达的改变

邢瀚文，陶 虹，赵玉琼,牛世博，李 霞，罗 彦,4

消化系统的研究发现在中暑或运动引起的热应激情况下，肠道黏膜屏障发生损伤，通透性增加，引起肠道内细菌入血，这可能与热应激时的菌血症有关[1]，而食管作为连接口腔和胃的器官，在吞咽食物的过程中发挥了重要的作用，食管黏膜上皮细胞层是保护食管免受食物的机械损伤或胃内反流物化学损伤的重要屏障。若将食管组织黏膜面直接暴露在模拟热饮的48 ℃环境下，食管黏膜上皮的间隙变大，电阻变小，提示黏膜上皮功能屏障功能受损[2]。而在慢性束缚应激的小鼠食管发现，与上皮细胞屏障功能有关的紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达发生改变，同时应激时具有致炎和抗炎双重作用的蛋白酶切激活受体-2(PAR-2)及其激活剂来源肥大细胞数目在食管或肠道中也发生了改变，它们可通过引起炎症或氧化应激来影响上皮细胞的功能[3]。那么在热暴露引起的热应激情况下，食管黏膜上皮紧密连接蛋白及PAR-2又是如何变化的呢。本研究通过建立大鼠热暴露的动物模型，观察热暴露引起的热应激情况下大鼠食管组织紧密连接蛋白Occludin和ZO-1，PAR-2的表达情况。

1 材料与方法

1.1 建立大鼠热暴露模型：8只成年雄性SD 大鼠随机分为对照组和热暴露组(每组4只)，体重190～200 g，各组大鼠分别正常饲养3 d 后，热暴露组开始在人工气候仓内进行适应性热暴露2 h(32 ℃)/d，6 h(32 ℃)/d,14 h(32 ℃)/d,18 h(32 ℃)/d，共4 d，从第8天开始持续进行热暴露24 h(32 ℃)共10 d，对照组始终正常饲养。每天记录大鼠体重、饮食、饮水变化，观察大鼠一般状况。

1.2 大鼠食管组织石蜡切片：10%水合氯醛麻醉(0.3 mL/100 g)大鼠后，开胸，用小镊子原位游离分离颈胸段食管后，剪断。在生理盐水中反复冲洗使组织上无血液附着，小心去除附着的结缔组织，滤纸吸干水分后投入4%多聚甲醛固定。经过固定的组织样本经梯度乙醇脱水、二甲苯透明以后，55 ℃左右石蜡包埋，常规4 μm切片，贴于处理过的载玻片上，温箱中烤片过夜后，收集至载片盒中保存。进行常规HE染色。

1.3 免疫组织化学染色：石蜡包埋食管组织进行4 μm切片，60 ℃烤片1 h 后，进行二甲苯脱蜡，水化，3%过氧化氢阻断内源性生物素，微波修复，Occludin和ZO-1用EDTA抗原修复液进行微波修复，PAR-2用枸橼酸盐抗原修复液进行修复。然后兔抗occludin(1∶200,Abcam,ab216327),兔抗ZO-1(1∶500,Bioss,bs-1329-R),兔抗PAR-2(1∶250,Bioss,bs1178R)，4 ℃过夜，β-actin 为内参，免疫组化试剂盒进行后续实验。

1.4 Western blot实验：研磨钵中倒入少许液氮预冷，称取食管组织，在液氮中尽量将食管组织研磨碎，待液氮挥发后，将食管组织倒入1.5 mL离心管中，管中预先根据重量体积比加入了预冷的裂解液。后将离心管置于涡旋振荡器上充分震荡裂解，每次震荡30 s，重复3次，在低温高速离心机中以12 000 rpm 的速度离心5 min，离心完成后小心吸取上清液，根据BCA法进行蛋白定量，之后按样品∶loading-buffer= 4∶1 的比例加入 Loading-buffer，100 ℃热水加热变性。anti-Occludin(1∶1 000,Abcam,ab216327),anti-ZO-1(1∶500,Bioss,bs-1329-R),anti-PAR-2(1∶500,Bioss,bs1178R)，4 ℃过夜，二抗室温1 h，ECL显色。用Image J软件进行灰度值分析。

2 结果

2.1 热暴露后大鼠一般情况及体重变化：对照组与热应激组大鼠均正常存活，随着饲养时间的增加，2组大鼠的体重均持续增长,而从持续24 h热暴露(第9天)开始，热应激组大鼠体重增长比对照组多一点，但与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2 热暴露后大鼠食管组织学改变：食管组织进行HE染色，可见在食管腔面有角化细胞层，接着是多层多角形的鳞状细胞，基底层可见颗粒细胞，热暴露后，食管上皮未见明显缺失和结构异常。

2.3 热暴露后大鼠组织紧密连接蛋白Occludin、ZO-1和PAR-2的表达：从免疫组织化学染色结果看到紧密连接蛋白Occludin主要表达于食管黏膜复层扁平上皮细胞层，定位于细胞膜上，且热暴露后阳性细胞数减少；ZO-1主要表达于复层扁平细胞的细胞核,热暴露后表达不变或轻度增加；PAR-2主要表达于食管黏膜上皮细胞，定位于细胞浆，热暴露后黏膜上皮细胞层PAR-2表达下降，见图1(封三)。

取食管组织进行Western blot实验，结果显示，热暴露后食管组织PAR-2表达减少，紧密连接蛋白Occludin表达下降，ZO-1表达升高,对照组PAR-2的灰度值是0.349±0.0765，热暴露后下降为0.264±0.0392，2组比较差异有统计学意义(P<0.05),Occludin的蛋白灰度值为1.354±0.520，热暴露后为0.753±0.436(P<0.05)，ZO-1的表达从0.245±0.103升高为0.666±0.233，2组比较差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

3 讨论

消化道黏膜上皮形成了一层分隔消化道内容物和内环境的屏障，该屏障选择性地过滤肠内容物，同时防止肠内有害病原微生物或抗原进入循环，其中位于细胞和细胞之间的紧密连接对于维持屏障功能的完整性尤为重要，可通过调节紧密连接蛋白来调节黏膜的屏障功能[4]。而紧密连接蛋白中的跨膜屏障蛋白 claudins，occludin 等能促进细胞粘附及形成细胞旁屏障。胞浆内“脚手架蛋白”(ZO)对于紧密连接的形成和细胞极性的调节而言非常重要。研究发现热应激可降低育肥猪空肠Occludin和ZO-1的表达[5]。本研究也发现，在热暴露的大鼠食管组织上皮细胞间紧密连接蛋白Occludin表达下降，阳性细胞数减少，而Occludin是形成细胞紧密连接及维持细胞屏障功能的重要蛋白，它的表达下降，提示细胞紧密连接减少，细胞屏障功能减弱，这与其他研究结果一致。同时，我们观察到另一个重要的细胞紧密连接蛋白ZO-1表达升高，这与其他类似研究不一致，可能与热暴露时间及模式不同有关。而与对照组相比，大鼠食管组织学观察没有发现明显的损害，这与之前的研究一致，当兔食管组织暴露于40℃时，无论暴露时间长短，均不会造成组织学改变[6]。同时，热暴露组大鼠的体重增长与对照组大鼠相比也没有统计学差异，因此，本研究中热暴露没有明显改变大鼠生长情况，在没有对食管黏膜组织造成明显组织学改变的情况下，热暴露引起的热应激也可改变食管上皮紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达，从而影响食管上皮细胞的屏障功能。

蛋白酶切激活受体-2(PAR-2)是蛋白酶切激活受体家族的一员，具备多种生物学功能，具有致炎和抗炎的双重作用，它被肥大细胞来源的类胰蛋白酶激活。在大鼠避水应激时，肠道黏膜PAR-2表达上调，肥大细胞数目增加，紧密连接蛋白表达下调[7]。当慢性束缚应激时，小鼠食管上皮屏障功能紊乱，表现为细胞间隙增大，某些紧密连接蛋白表达降低，并且肥大细胞数目与PAR-2表达也升高[3]。当抗氧化物质表达下降时，食管及血浆中炎性因子水平显著升高[8]，提示肥大细胞来源的类胰蛋白酶激活PAR-2可能参与了应激后食管上皮细胞屏障功能紊乱。本研究中发现热应激后食管上皮细胞PAR-2表达下降，这一不同可能与应激的种类和程度不同以及器官功能特异性有关。食管的结构与消化道其他地方不同，与胃和肠道相比，具备独特的黏膜下腺体，黏膜下神经丛，对于应激和损伤的反应因此也可能有所不同[9-10]。而对于慢性应激的刺激，近端结肠和远端结肠PAR-2及肥大细胞的变化确实存在区域差异[11]。

屏障功能紊乱一方面可能引起肠道内微生物重定植，比如热暴露引起的热应激会损伤肠黏膜屏障，引起菌血症；另一方面，慢性应激会增加小鼠食管炎性介质，促进氧化应激，参与内脏高敏感性的发生[1]，或者引起应激性溃疡[12]。因此研究应激情况下引起屏障功能改变的机制非常重要，本研究没有探讨热暴露引起的热应激大鼠食管上皮紧密连接蛋白和PAR-2表达改变的详细机制，而在应激情况下，糖皮质激素会抑制皮肤表皮层细胞的增殖和分化，减弱屏障功能的稳定性,减少角质层的完整[13]。肾上腺素通过作用于β-1,2,3受体,减弱皮肤成纤维细胞的活动[14]，临床研究也发现感染性休克的病人去甲肾上腺素的使用与肠细胞的损害有关[15]。因此，应激时各种体液因素可能参与了对食管上皮紧密连接蛋白及PAR-2表达的调控，但需要进一步的实验进行验证。