一测多评法同时测定红参中11种人参皂苷的含量

徐文武，谢 涛，吕东峰，杨 婷，张臻臻，魏西羽，孙 越，刘厚汝，李 伟，于德红

一测多评法同时测定红参中11种人参皂苷的含量

徐文武，谢 涛，吕东峰，杨 婷，张臻臻，魏西羽，孙 越，刘厚汝，李 伟*，于德红*

华北理工大学药学院，河北 唐山 063200

建立一测多评法（quantitative analysis single-marker，QAMS）测定红参药材中11种皂苷类成分的含量，为红参质量控制提供科学依据。采用HPLC法，Agilent C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相梯度洗脱，体积流量1.3 mL/min，柱温30 ℃，波长203 nm。以人参皂苷Rb1为参照物，建立其与人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rc、人参皂苷Ro、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg3的相对校正因子，外标法与QAMS分别测定11个成分含量。在一定线性范围内，人参皂苷Rb1相对人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rc、人参皂苷Ro、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg3的相对校正因子重复性好，2种方法所得11种成分的含量无明显差异，实验得相对校正因子可供参考。本研究建立的QAMS法，快速、简便、重复性好，可为红参药材的质量控制提供参考。

红参；高效液相色谱法；一测多评；相对校正因子；人参皂苷Rg1；人参皂苷Re；人参皂苷Rf；人参皂苷Rh1；人参皂苷Rc；人参皂苷Ro；人参皂苷Rb2；人参皂苷Rb3；人参皂苷Rd；人参皂苷Rg3；质量控制

人参C. A. Mey. 作为世界上最常用的草药之一，已经有几千年的使用历史。红参是人参采收后经过加工的产物，在《中国药典》2020年版中红参为五加科植物人参C. A. Mey.的栽培品经蒸制后的干燥根及根茎，秋季采挖、洗净、蒸制后，干燥[1]。红参具有大补元气、复脉固脱、益气摄血的功效，是历史悠久的传统名贵中药材。红参含有人参皂苷、多糖、脂肪酸和挥发油等多种活性成分，其中人参皂苷是红参主要的生物活性成分，目前已经从红参中分离鉴定出了一百多种人参皂苷[2-4]，人参皂苷是评价红参内在质量的重要指标。研究表明，人参皂苷具有抗炎[5]、抗肿瘤[6]、免疫调节[7]、保护神经系统[8]、抗糖尿病[9]等药理作用。

在红参药材质量控制方面，《中国药典》2020年版只对人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb13种人参皂苷含量做出规定，质量控制指标少。另外使用传统的外标法进行人参皂苷的含量测定，存在实验操作繁琐、对照品稀缺昂贵等情况[10]。在本研究对红参中主要人参皂苷（人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Ro、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rd）测定的同时，对红参中稀有人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb3及人参皂苷Rg3进行测定，且针对传统使用的外标法操作繁琐、对照品昂贵稀缺等情况，本实验采用一测多评法（QAMS）同时测定红参中11种人参皂苷的含量，不仅可以节省对照品用量，简化实验流程，还可以更加全面地评价红参质量，为红参的质量控制提供参考。

1 材料与仪器

1.1 材料

人参皂苷Rg1（批号110703-201832，质量分数92.4%）、人参皂苷Re（批号110754-201827，质量分数93.4%）、人参皂苷Rb1（批号110704-201827，91.2%）、人参皂苷Rb2（批号111715-201203，质量分数93.8%）、人参皂苷Rd（批号111818-201603，质量分数92.1%）对照品购自中国食品药品检定研究院；人参皂苷Rf（批号100269-201903）、人参皂苷Rc（批号110006-201810）、人参皂苷Ro（批号180002- 202005）、人参皂苷Rb3（批号200613- 201906）、人参皂苷Rg3（批号100274-201908）人参皂苷Rh1（批号160010-201904）对照品购自南京源植生物科技有限公司，质量分数均≥98%；红参药材来源见表1，经华北理工大学药学院于德红教授鉴定为五加科植物人参C. A. Mey.的干燥根及根茎。

1.2 仪器

Shimadzu LC-2030高效液相色谱仪，LC Solution色谱工作站（日本岛津公司）；KQ-300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；YS-04小型高速粉碎机（北京燕山正德机械设备有限公司）；ME155DU/02十万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。甲醇、乙腈均为液相色谱级；水为娃哈哈纯净水；其余试剂为分析纯。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱：0～30 min，19% A；30～35 min，19%～24% A；35～80 min，24%～40% A；80～100 min，40%～49% A；体积流量 1.3 mL/min；柱温30 ℃；检测波长203 nm；进样量10 μL。HPLC图谱见图1。

1-人参皂苷Rg1 2-人参皂苷Re 3-人参皂苷Rf 4-人参皂苷Rh1 5-人参皂苷Rb1 6-人参皂苷Rc 7-人参皂苷Ro 8-人参皂苷Rb2 9-人参皂苷Rb3 10-人参皂苷Rd 11-人参皂苷Rg3

2.2 对照品溶液的制备

精密称取各对照品适量，加甲醇溶解制成人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Ro、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg3对照品质量浓度分别为0.115、0.100、0.081、0.050、0.102、0.105、0.140、0.140、0.080、0.095、0.056 mg/mL的混合对照品溶液。放于冰箱4 ℃保存、备用。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取红参（粉碎后过四号筛）粉末1 g，用滤纸包裹后放入索氏提取器中，加适量三氯甲烷，75 ℃加热回流3 h后，弃去三氯甲烷液，待药渣溶剂挥干，同滤纸筒转移到具塞锥形瓶中，再精密量取水饱正丁醇50 mL加入锥形瓶，密塞，放置过夜，超声处理30 min，滤过。精密量取续滤液25 mL，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀、过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系的考察 分别精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液1、2、4、8、10、20 μL注入高效液相色谱仪，平行3针，按“2.1”项下色谱条件测定，记录相应的色谱峰面积。以进样量为横坐标（），峰面积为纵坐标（），进行线性回归，得人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Ro、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg3的回归方程及线性范围。结果表明11个成分的线性关系良好，如表2所示。

2.4.2 精密度试验 精密吸取混合对照品10 μL，按“2.1”色谱条件下进样分析，在同一日内连续重复进样6次，记录各色谱峰面积值，结果人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Ro、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg3峰面积的RSD分别为0.84%、1.32%、0.75%、0.88%、0.79%、1.47%、0.64%、0.46%、0.91%、1.47%、0.81%，表明仪器的精密度良好。

2.4.3 重复性试验 取同一批红参药材（批号20181125）按“2.3”供试品溶液的制备方法，平行制备6份供试品，在“2.1”色谱条件下测定，每次进样量10 μL，计算人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Ro、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg3的平均质量分数分别为2.372、0.637、0.573、0.136、3.679、1.838、1.936、1.149、0.083、0.569、0.086 mg/g，RSD分别为1.85%、2.63%、2.59%、1.10%、2.96%、2.20%、2.92%、2.33%、1.62%、1.24%、2.56%，表明该方法的重复性良好。

表2 11个人参皂苷成分回归方程与线性范围

2.4.4 稳定性试验 取同一份红参供试品溶液（批号20181125），室温下放置，分别于0、2、4、8、12、24 h在上述色谱条件下测定，每次进样量10 μL，记录峰面积。计算得，人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Ro、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg3峰面积的RSD分别为0.75%、0.88%、0.34%、0.91%、1.63%、1.43%、2.58%、0.88%、0.94%、1.71%、1.83%，表明溶液在24 h内的稳定性良好。

2.4.5 加样回收率试验 精密称取已测定红参（批号20181125，相当于含人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Ro、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg3分别为1.186、0.318、0.286、0.068、1.839、0.919、0.499、0.574、0.041、0.284、0.043 mg）粉末0.5 g，平行称取6份，以药材中各成分-对照品量（1∶1）的比例加入一定量的对照品，再按“2.3”项方法平行制备6份供试品溶液，测定11种人参皂苷的峰面积，并计算出相应的加样回收率和RSD。人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Ro、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg3的加样回收率分别为100.60%、99.15%、101.82%、98.95%、101.93%、98.30%、100.52%、99.57%、98.54%、102.59%、101.74%，RSD分别为1.65%、1.43%、1.57%、1.12%、1.96%、1.21%、2.24%、1.68%、1.57%、1.12%、2.41%。

2.5 相对校正因子（f）的确定

校正因子的计算按线性关系考察项下的试验方法，＝f/s＝(A/W)/(s/s)[11]，A为待测成分的峰面积，W为待测成分的质量；s为内参物s的峰面积，s为内参物s的质量。取“2.2”项下混合对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下，进样体积1、2、4、6、8、10、15、20 μL下，分别计算人参皂苷Rb1、Ro作为内参物时，11种人参皂苷的，并将结果进行比较，结果见表4、5。结果表明，人参皂苷Rb1和人参皂苷Ro作为内参物时RSD均小于3%符合实验要求，根据价廉易得的原则本实验选取人参皂苷Rb1作为内参物。

表4 人参皂苷Rb1作为内参物各成分f

表5 人参皂苷Ro作为内参物各成分f

2.6 f的耐用性评价

2.6.1 不同色谱柱系统对的影响 实验采用Shimadzu LC-2030高效液相色谱系统和Agilent 1260高效液相色谱系统，分别考察了3根不同厂家的色谱柱（Agilent XDB C18、Waters sunfire C18、H＆E ODS C18）对各人参皂苷的影响，结果人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Ro、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg3的RSD依次为1.22%、1.62%、1.30%、2.70%、1.30%、1.63%、1.08%、0.91%、0.99%、1.75%，表明不同色谱系统及不同色谱柱对各成分无显著性影响，结果见表6。

2.6.2 柱温对的影响 实验采用Shimadzu LC-2030高效液相色谱仪系统，Agilent XDB C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），考察不同柱温（28、30、32、34 ℃）对的影响，结果显示各成分的RSD均小于3%，表明柱温对各成分的无显著影响，结果见表7。

表6 不同色谱柱系统对f的影响

表7 不同柱温对f的影响

2.6.3 不同流动相体积流量对的影响 实验采用Shimadzu LC-2030高效液相色谱仪系统，Agilent XDB C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），考察了不同体积流量（1.0、1.1、1.2、1.3 mL/min）对的影响，各成分的RSD均小于3%，表明不同体积流量对各成分无显著影响，结果见表8。

表8 不同体积流量对f的影响

2.7 待测成分色谱峰的定位

在QAMS的运用中，目前常用的色谱峰定位方法有相对保留值法、保留时间差、时间校正法、对照提取物法等。保留时间差法计算公式：Δt/s=t－s。相对保留值计算公式：t/s=t/s。本实验选取相对保留值作为色谱峰的定位方法[12-13]。本实验采用相对保留时间进行待测组分色谱峰的定位，采用Shimadzu LC-2030高效液相色谱系统和Agilent 1260高效液相色谱系统，分别考察了3根不同厂家的色谱柱（Agilent XDB C18、Waters sunfire C18、H＆E ODS-A C18）中各待测成分的相对保留时间。测定结果为Rg1/Rb1＝0.6040、Re/Rb1＝0.6165、Rf/Rb1＝0.8548、Rh1/Rb1＝0.9598、Rc/Rb1＝1.0425、Ro/Rb1＝1.0499、Rb2/Rb1＝1.0828、Rb3/Rb1＝1.0975、Rd/Rb1＝1.1630、Rg3/Rb1＝1.5656，波动较小，RSD分别为0.342 2%、1.217 5%、0.954 9%、0.643 8%、0.374 0%、1.005 9%、0.357 8%、0.381 3%、0.250 8%、0.284 2%均小于3%，无显著性差异，如表9所示。

2.8 QAMS和外标法测定结果比较

10批红参药材，按“2.3”项下供试品制备方法，“2.1”项下方法分析，采用QAMS与外标法分别计算各成分含量，QAMS定量计算公式如下。w＝(s×A)/(×s)，s为参照物峰面积，s为参照物量；A为待测成分峰面积，w为待测成分量；为参照物与待测成分[14-15]，将QAMS计算值与外标法实测值进行配对检验，结果值均＞0.05，表明2种测定方法的结果无显著性差异，结果见表10。

表9 相对保留时间

表10 QAMS与外标法含量测定结果

3 讨论

3.1 色谱条件的考察

本实验考察了流动相磷酸水比例，流动相体积流量，在流动相磷酸水比例选取方面考察了乙腈-0.05%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水以及乙腈-水3种比例，结果在乙腈-0.05%磷酸水和乙腈-水为流动相时，基线出现较大漂移，而以乙腈-0.1%磷酸水为流动相基线稳定性好且峰形尖锐。在流动相体积流量方面，考察了1.0、1.1、1.2、1.3 mL/min 4种体积流量，结果发现前3种体积流量人参皂苷Rg1与人参皂苷Re的峰没能得到完全分离，在体积流量为1.3 mL/min时人参皂苷Rg1与人参皂苷Re得到有效分离，且其它各成分峰形均较好。因此本实验在乙腈-0.1%磷酸水为流动相的基础上设定流动相体积流量为1.3 mL/min。

3.2 红参QAMS质量评价

在红参的质量控制方面，《中国药典》2020年版规定红参中人参皂苷Rg1和人参皂苷Re含量不少于0.25%，人参皂苷Rb1含量不少于0.20%。本研究在此基础上，采用QAMS同时测定了11种人参皂苷的含量，并且其中人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb3和人参皂苷Rg3是红参中稀有皂苷，对其进行测定可以更好的全面评价红参的质量。QAMS含量测定结果与外标法进行了验证，结果表明QAMS测定结果与外标法测定结果无显著性差异，因此可用QAMS代替外标法对红参中人参皂苷进行含量测定，采用QAMS可用一个内参物即可求得其它成分的含量，在节省实验成本的同时，也减少了科研人员的时间成本，更加快速准确的对红参质量做出评价。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Simultaneous determination of 11 saponins components in red ginseng by QAMS method

XU Wen-wu, XIE Tao, LV Dong-feng, YANG Ting, ZHANG Zhen-zhen, WEI Xi-yu,SUN Yue, LIU Hou-ru, LI Wei, YU De-hong

School of Pharmacy, North China University of Science and Technology, Tangshan 063200, China

To establish a quantitative analysis of multi-components by single maker (QAMS) for the content determination of eleven saponins in red ginseng, so as to provide a scientific basis for the quality control of red ginseng,. Methods The HPLC analysis was performed on Agilent C18column (250 mm×4.6 mm, 5 μm), using acetonitrile and 0.1% phosphoric acid solution as the mobile phase at a flow rate of 1.3 mL/min, and column temperature was 30 ℃ and the detection wavelength was set at 203 nm. Ginsenoside Rb1was used as reference to establish its relative correction factor of Rg1, Re, Rf, Rh1, Rc, Ro, Rb2, Rb3, Rd and Rg3. The contents of eleven components were determined by both external standard method and QAMS.Within a certain linear range, ginsenoside Rb1 had better reproducibility than ginsenoside Rg1, Re, Rf, Rh1, Rc, Ro, Rb2, Rb3, Rd, and Rg3in terms of relative correction factors. There was no significant difference in the contents of 11 components obtained by the two methods. The relative correction factors obtained in the experiment could be used for reference.The establishment of multi-components by single maker method in this study is rapid, simple and reproducible, which can provide reference for the quality control of red ginseng.

red ginseng; HPLC; quantitative analysis of multi components with a single marker; relative correction factor; ginsenoside Rg1; ginsenoside Re; ginsenoside Rf; ginsenoside Rh1; ginsenoside Rc; ginsenoside Ro; ginsenoside Rb2; ginsenoside Rb3; ginsenoside Rd; ginsenoside Rg3quality control

R286

A

0253 - 2670(2021)07 - 2099 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.07.027

2020-09-06

华北理工大学博士科研启动基金项目（No.28418499）

徐文武（1993—），在读硕士，研究方向为中药质量控制。E-mail: 1150403761@qq.com

李 伟（1977—），研究员，研究方向为药物分析与药物代谢动力学。E-mail: liwei@ncst.edu.cn

于德红（1971—），副教授，博士，研究方向为中药药效物质基础。E-mail: ydh613@163.com

[责任编辑 时圣明]