许淑君,孟 晶,周炜炜,王朋倩,张 淼,吴 茵,杨秀娟,隋 峰
基于内源性代谢物探索吴茱萸辛热药性的生物学表征规律
许淑君,孟 晶,周炜炜,王朋倩,张 淼,吴 茵,杨秀娟,隋 峰*
中国中医科学院中药研究所,北京 100700
基于代谢组学技术,通过小鼠血清内源性代谢物的变化寻找吴茱萸发挥生物效应的代谢途径和有关靶点,研究吴茱萸发挥疗效的分子机制。小鼠随机分为对照组和吴茱萸组,给予吴茱萸进行干预,采用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)技术分析2组小鼠血样,采用主成分分析、偏最小二乘判别分析、正交偏最小二乘判别分析等方法,筛选差异代谢物并进行代谢通路分析;使用Cytoscape及Metscape软件对差异代谢物进行网络模块化分析,筛选可能的作用靶点。数据模式识别显示吴茱萸组与对照组血清样本完全分离;共获得13个差异表达代谢物;通路分析共获得4条通路;网络模块化分析共获得11个模块,其中花生四烯酸代谢通路和亚油酸代谢通路是最大的2个模块;在整个模块中,烟酰胺、花生四烯酸、棕榈酸、亚油酸节点度均大于均值,涉及的通路包括烟酸和烟酰胺代谢、花生四烯酸代谢、亚油酸代谢及饱和脂肪酸β-氧化;通过筛选获得细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)酶系相关的26个基因。吴茱萸可能通过作用于CYP450酶系,影响花生四烯酸、亚油酸、烟酸和烟酰胺等代谢途径,调控机体能量代谢,进而实现生物效应。
吴茱萸;内源性代谢产物;代谢组学;花生四烯酸代谢;细胞色素P450
中药药性理论是中医药理论体系的重要组成部分,四性五味是药性理论的核心内容。充分利用现代科技手段揭示中药性味理论的生物内涵对于实现中医药理论的客观化和标准化、提高中医药的临床诊治能力至关重要。吴茱萸为芸香科植物吴茱萸(Juss.) Benth.、石虎(Juss.) Benth. var.(Dode) Huang或疏毛吴茱萸(Juss.) Benth. var.(Dode) Huang的干燥近成熟果实[1],是临床常用的典型辛热性中药,具有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻的功效,主要用于治疗厥阴头痛、寒疝腹痛、寒湿脚气等[2-4]。课题组前期研究发现,调节机体能量代谢可能是辛热中药发挥生物效应、表征药性的关键环节和作用途径[5]。为深入揭示其内在的分子机制,本研究借助代谢组学的相关技术和方法,以内源性代谢产物为主要指标,以吴茱萸为研究示例,通过给药前后小鼠血清中内源性代谢物的差异分析和比对研究,发现主要相关靶点和通路,解析其生物表征模式和特点,为全面揭示中药药性理论内涵提供依据。
吴茱萸购自北京同仁堂,经中国中医科学院中药资源中心袁庆军研究员鉴定为芸香科植物吴茱萸(Juss.) Benth.的干燥近成熟果实。
清洁级雄性昆明种小鼠20只,4~5周龄,体质量为18~22 g,购自军事医学科学院,合格证号SCXK-(军)2012-0004。动物饲养于动物房,温度(26±1)℃,自由饮食饮水,适应性饲养7 d。动物实验遵循中国中医科学院中药研究所有关实验动物管理和使用的规定,均符合3R原则。
色谱级甲酸(批号152469)、色谱级甲酸铵(批号152469)、色谱级甲醇(批号152469)、色谱级乙腈(批号136376)购自美国Thermo Fisher Scientific公司;超纯水购自屈臣氏集团。
电子天平(美国Mettler Toledo公司);BSA223S型电子分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司);BCD-320D11D型冰箱(信科龙电器股份有限公司);JIDI-16R台式多用途高速冷冻离心机(广州吉迪仪器有限公司);DW-HL388型−80 ℃超低温冰箱(中科美菱低温科技有限责任公司);Q EXACTIVE质谱仪、DIONEX Ultimate3000超高效液相色谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司);Milli-Q Advantage A10型超纯水仪(Millipore公司);KQ-250超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)数据库(https://www.genome.jp/kegg/ligand.html)[6-7];Metabo Analyst 4.0数据库(https://www.metaboanalyst.ca/)[8];Metlin数据库(http://metlin.scripps.edu/)[9];Mzcloud数据库(https://www.mzcloud.org/);HMDB数据库(https://www.hmdb.ca)[10];MetScape插件(http:// apps.cytoscape.org/apps/metscape)[11];Cytoscape 3.7.0软件(https://www.cytoscape.org/)[12];Trace Finder软件。
称取吴茱萸,加入蒸馏水(用量为浓缩后药液体积的10倍量体积)浸泡30 min后,武火煮至药液沸腾,转用文火煎煮30 min,用8层纱布滤过,重复煎煮1次。合并2次滤液,文火浓缩至药液质量浓度为0.15 g/mL(以生药量计)。
小鼠随机分为对照组和吴茱萸(2.25 g/kg,相当于临床等效剂量)组,每组10只。吴茱萸组小鼠ig药物(15 mL/kg),对照组小鼠ig等体积蒸馏水,1次/d,连续4 d。
给药结束后,小鼠眼球取血,脱颈椎处死。血样于4 ℃静置2 h,4 ℃、11 985×离心10 min,取上层血清,于−80 ℃保存备用[13]。吸取50 μL血清,加入450 μL沉淀剂甲醇-乙腈(1∶1),涡旋30 s,4 ℃、11 985×离心10 min,吸取上清液,进样分析。
2.4.1 色谱条件 Thermo Syncronis C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm),流动相A为含0.1%甲酸、2 mmoL/L甲酸铵的水,流动相B为乙腈,梯度洗脱:0~1.00 min,95% A;1.00~25.00 min,95%~5% A;25.00~30.00 min,5% A;30.00~30.01 min,5%~95% A;30.01~35.00 min,95% A;进样量5 μL;体积流量0.3 mL/min。
2.4.2 质谱条件 选择ESI离子源正、负离子同时扫描模式;一级全扫描分辨率为70 000,扫描范围/50~1000;二级数据依赖性扫描分辨率为17 500;鞘气体积流量为10.5 L/min;辅助气体积流量为3 L/min;电喷雾电压为2800 V;Stepped NCE值分别为20、40、60 V;毛细管温度为320 ℃。
考察血清样品和沉淀剂(1∶3、1∶6、1∶9)的比例关系,结果显示血清样品与沉淀剂比例1∶9效果最好,适用于本研究中沉淀小鼠血清样品的蛋白杂质。
在Mzcloud数据库中鉴别小鼠血清中内源性代谢物的相对分子质量和分子式,选择Trace Finder自行建立代谢物数据库,进行峰对齐、保留时间校正、峰面积提取操作[14]。利用HMDB、KEGG、Metlin等数据库对化合物信息进行检索和确认。使用Metabo Analyst 4.0中正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis,OPLS-DA)、偏最小二乘判别分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)、主成分分析(principal component analysis,PCA)、聚类分析、高通量代谢通路分析等方法进行分析。通过PLS-DA模型筛选出变异权重系数(VIP)>1的离子,结合单变量统计分析FC>0.5且<0.05的限制条件,找出差异性代谢物。利用Cytoscape 3.7.0软件中MetScape插件绘制代谢网络图,预测靶点。
以缬氨酸为例鉴定内源性物质,图1-A为正、负离子模式图,图1-B为正离子模式下缬氨酸的色谱峰,图1-C为正离子模式下缬氨酸色谱峰所对应的二级质谱。
图1 总离子流图 (A)、正离子模式下1.08 min出现的色谱峰(B)及其对应的母核离子碎片(C)
3.2.1 吴茱萸组与对照组血清UPLC-MS/MS数据模式识别 对吴茱萸组与对照组血清样本进行PCA分析,结果如图2-A、B所示,2组血清样本表现一定的聚集趋势,但未能完全分离。采用PLS-DA和OPLS-DA分析方法对吴茱萸组和对照组小鼠血清样本数据展开模式识别,结果如图2-C~F所示,在有监督的情况下2组样本聚集性更强,能够完全分离。OPLS-DA分析方法能够更大程度地体现2组样本的聚集性和分离性,表明吴茱萸使小鼠内源性代谢产物产生了改变。
对2组数据进行聚类分析,如图3-A所示,从树状图可以看出,吴茱萸组和对照组血清样本数据被完全聚集成不同的2类,每组数据在其自身样本内部再进行细分。如图3-B所示,PLS-DA分析发现2组样本中多个代谢物表现出显著差异。
K和绿色代表对照组,C和红色代表吴茱萸组,下图同
3.2.2 吴茱萸组与对照组差异代谢物筛选 利用PLS-DA分析获得血清代谢物的VIP值表,其中同时满足5种算法计算方式且VIP>1的差异代谢物共有21个。设计20(样本)×21(变量)的矩阵,采用检验手动积分进一步分析,最终筛选得到13个差异代谢物,结果见表1、2。
对“3.2.2”项中筛选得到的13个差异代谢物展开高通量代谢通路分析,结果见表3和图4,共获得5条相关代谢通路,分别为花生四烯酸代谢通路、亚油酸代谢通路、烟酸和烟酰胺代谢通路、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解通路。
图3 对照组和吴茱萸组血清样本聚类分析 (A) 及VIP大于1的部分代谢物 (B)
表1 吴茱萸组血清样本中13个差异代谢物的相对含量
与对照组比较:*<0.05**<0.01;↑表示上调,↓表示上调
*< 0.05**< 0.01control group; ↑ means up, ↓ means down
表2 吴茱萸组血清样本中13个差异代谢物信息
吴茱萸组与对照组分析获得的13个差异代谢物的代谢组学网络模块图如图5所示,该网络模块图可以划分成11个相关网络模块,其中蓝色圆形代表相关靶点、粉色六边形代表该通路中其他代谢物、红色六边形代表代谢通路中本研究获得的差异代谢物,边表示3种元素之间的关系。利用软件中Analyze network插件对网络模块图进行拓扑分析,结果见表4,对代谢网络模块图进行整体分析发现节点度值高于平均节点度的差异代谢物共有4个,分别是花生四烯酸(arachidonic acid)、亚油酸(linoleic acid)、烟酰胺(nicotinamide)和棕榈酸(palmitic acid)[15],上述4个差异代谢物分别是所构建的花生四烯酸代谢通路、亚油酸代谢通路、烟酸及烟酰胺代谢通路、饱和脂肪酸β-氧化通路的代谢产物,并且这4个通路在代谢组学网络模块图中占比最大。
表3 13个差异代谢物的相关通路分析
采用相关性分析与分层聚类分析方法对吴茱萸组和对照组小鼠的血清样本数据进行处理。对2组小鼠血清中的13个差异代谢物进行相关性分析,结果如图6所示,红色代表正相关性,包括乙酰左旋肉碱(-acetylcarnitine)、花生四烯酸、棕榈酸、油酸(oleic acid)、反油酸(elaidic acid)、肌酸(creatine)、二十碳六烯酸(docosahexaenoic acid)、亚油酸、硬脂酸(stearic acid)以及β-羟基丁酸(β-hydroxybutyrate);绿色代表负相关性,包括-缬氨酸(-valine)、甜菜碱(betaine)、烟酰胺(nicotinamide)。颜色越深,表示相关性越强,反之越弱。
图5 13个差异代谢物代谢组学网络模块图
表4 13个差异代谢物的代谢网络拓扑参数
分层聚类分析可得到13个差异代谢物的热图如图7所示,图中颜色深浅表示这些差异代谢物在2组之间数值变化的大小。从图中可以看出,吴茱萸组和对照组血清样本分离程度较好,表明吴茱萸给能够对机体代谢物产生一定的影响。
图6 13个差异代谢物相关性分析
图7 13个差异代谢物分层聚类分析热图
对上述代谢组学网络中的相关靶点进行预测,共获得80个相关基因,其中节点度高于平均值的基因共有26个,如表5所示,均为代谢网络模块图中2个最大模块的共有基因。利用度中心性、接近中心性和中介中心性算法对上述26个基因在代谢网络中的重要程度进行评估,发现26个基因度中心性值均为18、接近中心性值均为0.508 108 11、中介中心性值均为0.008 825 65,表明其在代谢网络中的重要性相同。进一步分析发现这26个基因同属细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)超家族,表明吴茱萸可能通过作用于CYP450来改变小鼠体内代谢物,进而发挥药效。本课题组前期对热性中药附子研究发现[16],其关键作用靶点也属于CYP450,提示热性中药发挥药效的作用机制可能与CYP450关系密切。
表5 代谢组学网络中度值大于平均值的基因
吴茱萸中含有生物碱、挥发油、苦味素等多种化学成分,其中生物碱是其主要的活性成分[17]。吴茱萸为临床常用的辛热性中药,现代药理学研究表明,吴茱萸碱具有抗炎镇痛、强心、降压、抗肿瘤、保护脑缺血损伤等多种药理作用[18-20]。炎症反应是当机体受到致炎因子感染或化学、物理损伤时迅速发生的直接性防御反应,主要表现为红肿热痛或功能障碍等[21]。吴茱萸碱能够通过抑制白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-1β、环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)等炎症因子的表达和释放,从而发挥抗炎作用[22]。
本研究基于代谢组学技术分析吴茱萸干预后小鼠血清中代谢物的变化,采用OPLS-DA、PLS-DA、PCA、聚类分析等方法识别小鼠血清样本数据变化模式。由PCA分析结果可知,吴茱萸组和对照组血清样本均有一定的聚集成群的趋势;PLS-DA和OPLS-DA结果显示,在有监督的情况下,吴茱萸组和对照组血清样本聚集趋势进一步增强,达到完全分离状态,表明吴茱萸组小鼠血清中代谢物水平发生显著变化。相关性分析和分层聚类分析结果显示,与对照组比较,吴茱萸组小鼠血清中代谢产物水平发生显著变化,且2组之间分离程度较好,验证了吴茱萸能够调节小鼠血清中代谢产物水平。经筛选共获得花生四烯酸、棕榈酸、亚油酸、硬脂酸、二十二碳六烯酸等13个差异代谢物,可作为吴茱萸干预后的生物标志物,除-缬氨酸、甜菜碱、烟酰胺水平呈上升趋势外,其余8个差异代谢物水平均为下降趋势。花生四烯酸、亚油酸、肌酸、棕榈酸等与机体蛋白质代谢、脂质代谢等能量过程密切相关[23-25],表明吴茱萸可能通过促进机体对花生四烯酸、亚油酸、肌酸等代谢产物的吸收和利用,影响机体能量代谢状态,发挥其辛热中药的药效作用,与课题组前期对热性中药生物效应研究的结果一致[26]。
本研究发现,亚油酸、花生四烯酸、烟酸及烟酰胺代谢通路是吴茱萸作用于机体的主要代谢通路。亚油酸能够刺激TNF-α、IL-1β、IL-8等多种炎症因子的表达,加速炎症反应[27];花生四烯酸作为一种具有重要生物功能的多不饱和脂肪酸,能够促进促炎介质的合成,放大炎症反应[28];烟酰胺能够通过调节机体能量代谢,阻断炎症细胞活化,抑制IL-8、IL-6、IL-1β等炎症因子的释放[29-30]。吴茱萸能够上调烟酸和烟酰胺代谢通路,抑制花生四烯酸和亚油酸代谢通路,提示这可能是吴茱萸作为辛热性中药发挥抗炎、调节免疫的作用机制之一。
代谢通路靶点分析结果表明,CYP450可能是吴茱萸在机体内发挥作用的关键靶点。CYP450作为机体内重要的代谢酶,能催化多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)生成不同的代谢产物[31-32]。花生四烯酸与CYP450关系密切,其在机体内的第三条代谢途径就是通过CYP2C、CYP2J2等的环氧化作用生成环氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids,EETs)[33-34]。EETs不仅能够维持心脏功能,还能够抑制单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子的释放,发挥抗炎作用[33]。因此,本研究中筛选获得的CYP2C、CYP2J2可能是吴茱萸发挥抗炎作用的靶点,但其确切的分子机制有待进一步研究。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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Exploring biological characterization of “hot” pungentbased on endogenous metabolites
XU Shu-jun, MENG Jing, ZHOU Wei-wei, WANG Peng-qian, ZHANG Miao, WU Yin, YANG Xiu-juan, SUI Feng
Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China
To explore the pathways and targets evoked by Wuzhuyu () as well as the molecular mechanism related to its biological effect through the changes of endogenous metabolites.Mice were randomly divided into control group andgroup,was given to intervene. The blood samples of two groups were analyzed by ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). The analysis methods such as principal component analysis, partial least squares discrimination analysis and orthogonal partial least squares discrimination analysis were selected to identify data patterns. Differential metabolites were screened according to VIP > 1 and manual integral calculation, and then the metabolic pathways analysis was performed. Cytoscape and Metascape software were used to establish the network modularization analysis of differential metabolites and screen possible targets.The result of data pattern recognition showed that serum sample ofgroup was completely separated from control group and 13 differential expressed metabolites were obtained. Fout pathways were found by pathway analysis. Network modular analysis obtained 11 modules in total, among which arachidonic acid and linoleic acid metabolic pathway were the two largest modules. In the whole module, the node degrees of nicotinamide, arachidonic acid, palmitic acid and linoleic acid were all greater than the mean. The pathways involved nicotinic acid and nicotinamide metabolism, arachidonic acid metabolism, linoleic acid metabolism and saturated fatty acid β-oxidation. A total of 26 genes were screened out, all of which were belong to cytochrome P450 enzyme system.may regulate energy metabolism and affect metabolic pathways of arachidonic acid, linoleic acid, nicotinic acid and nicotinamide by acting on cytochrome P450 enzymes to achieve biological effect.
(Juss.) Benth.; endogenous metabolites; metabolomics; arachidonic acid metabolism; cytochrome P450
R285.5
A
0253 - 2670(2021)07- 1994 - 09
10.7501/j.issn.0253-2670.2021.07.017
2020-12-09
国家自然科学基金面上项目(81873024);国家自然科学基金青年项目(81903819);北京市自然科学基金资助项目(7202143);中国中医科学院传承项目(KT18002ZX)
许淑君(1996—),女,硕士研究生,研究方向为中药学。Tel: 18811022024 E-mail: 1419189744@qq.com
隋 峰,博士生导师,研究员,研究方向为中药药性和药理。E-mail: suifeng2136@126.com
[责任编辑 李亚楠]