汉麻降脂肽氨基酸序列分析

宋淑敏 魏连会 董 艳 石 杰 潘 静 高 媛

(黑龙江省科学院大庆分院，大庆 163319)

高血脂是引发心脑血管疾病的主要诱因，严重危害人体健康。根据资料报道，中国成人血脂异常总体患病率已高达40.4%[1]。他汀类药物是目前治疗高胆固醇血症的常用药物。但长期使用降血脂药物会导致肌痛、肝肾损伤、过敏反应等副作用[2]。因此，从天然产物中获取具有降脂功能的活性物质是国内外学者研究的重要课题。食品中某些组分通过结合胆汁酸(盐)，并排出体外，阻止胆汁酸的重吸收，可促使血浆及肝脏中的胆固醇转化为胆汁酸，从而使血浆中的胆固醇含量下降，起到降血脂的效果[3]。已有研究表明来源于植物的多肽具有显著的降血脂作用。Yoshie-Stark等[4]研究发现羽扇豆蛋白及其酶解产物对胆汁酸具有一定的束缚作用。Kongo-Dia-Moukala等[5]研究表明玉米蛋白经过不同的蛋白酶消化后与胆酸盐的结合能力不同，但结合能力最强的大部分肽的分子质量为180～500 u。黄昆[6]研究山杏仁活性多肽浓度对胆酸盐吸附能力的影响，发现随着多肽浓度的增加，胆酸盐吸附率逐步增强 。于娜[7]进行了卵黄多肽降血脂活性研究，通过体外降血脂实验筛选出降血脂较强的组分EYP-4，经HSCCC制备分离得到的三个组分，利用纳升电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱(Nano-ESI-Ms/Ms)技术进行质谱分析，3个组分的氨基酸排列顺序分别为Lys-Glu-Pro-Ile、His-Ile-Pro-Leu和Lys-Glu-Tyr。由此可见，生物活性肽具有辅助的降血脂功效，蛋白多肽来源及肽段结构决定多肽降脂肽活性的强弱。

汉麻(CannabissativaL.)又称为工业大麻，在我国也称为火麻，是大麻科大麻属一年生草本植物。汉麻籽含有25%～35%脂肪，20%～25%蛋白质，20%～30%碳水化合物，并含有膳食纤维、维生素、矿物质等[8，9]。汉麻籽蛋白含有21种氨基酸，其中精氨酸含量高于一般的植物蛋白，汉麻蛋白中的65%为麻仁球蛋白，35%为白蛋白。与大豆蛋白相比，汉麻籽蛋白不含有致敏因子，更易于消化，因此汉麻籽是一种优异的蛋白质来源[10]。汉麻籽不仅营养价值较高，而且还具有很好的医疗功效。《神农本草经》《日用本草》《本草纲目》等都对汉麻籽的药效做了介绍，2002年火麻仁(汉麻仁)已列入我国药食同源目录中，这些都说明了汉麻籽在功能食品、医药等方面有巨大的应用价值[11，12]。李永进等[13]研究了火麻仁蛋白对小鼠抗疲劳和免疫调节功能的影响。丛涛等[14]进行了火麻仁蛋白质粉对生长期大鼠营养生理功能的影响研究，结果表明火麻蛋白质具有调节血糖、血脂和血小板水平,促进脑组织发育等作用,是一种有益健康的优质植物蛋白质资源。迄今为止，国内外关于汉麻籽多肽方面的研究报道较少，国内在汉麻籽多肽制备工艺[15]、汉麻籽多肽抗氧化[16]、汉麻籽多肽降血糖[17]等研究方面已取得进展，而有关汉麻籽多肽降血脂活性研究还鲜见报道。

本研究在前期复合酶法制备汉麻籽多肽研究的基础上，通过汉麻籽多肽体外降血脂作用及其序列分析，探讨汉麻籽多肽降血脂活性与氨基酸组成的关系，以期为汉麻降脂肽构效关系的深入研究以及汉麻降脂肽在功能食品、医药中的开发应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

汉麻籽多肽：采用复合酶解法制备；木瓜蛋白酶(酶活力为8×105U/g)、中性蛋白酶(酶活力为 1.3×105U/g)、胃蛋白酶、胰蛋白酶、糠醛、硫酸、 CHCA、乙腈、三氟乙酸。

1.2 仪器与设备

VFD-6000型真空冷冻干燥机，HA221-50-06型超临界CO2萃取设备，BIOQ-MU1000型切向膜过滤系统，紫外可见分光光度计， 4 800 Plus MALDI TOF/TOFTM Analyzer(AB SCIEX)，Q-Exactive质谱仪，Easy nLC1000纳升级液相色谱仪，真空离心浓缩仪。

1.3 方法

1.3.1 不同分子质量汉麻籽多肽的制备

称取一定质量的汉麻籽蛋白，按照1∶10料液比加入蒸馏水溶解，加入3.0%的中性蛋白酶，0.4%的木瓜蛋白酶，酶解pH为5.0，酶解温度为70 ℃，酶解时间为3 h。酶解结束后，将酶解液进行水浴(95 ℃)灭酶。将酶解得到的汉麻蛋白酶解液，采用超滤系统，用截留分子质量为1、3、5 ku的过滤膜进行分离纯化，截留4种不同分子质量的汉麻籽多肽如表1所示，将汉麻籽多肽混合液及4种不同分子质量多肽液分别冷冻干燥，制得的多肽冻干粉放入-20 ℃冰箱保存备用。

表1 不同分子质量汉麻籽多肽各个组分分子质量

1.3.2 胆酸盐标准曲线的建立

分别称取胆酸盐0、 40、80、120、160、200 mg 置于100 mL 棕色容量瓶中，用去离子水定容，配成胆酸盐标准溶液。采用糠醛显色法测定胆酸盐的含量[18]，分别取各浓度的胆酸盐标准溶液2 mL，加入 40% H2SO4溶液6 mL，摇匀，加入1%糠醛溶液1 mL，混匀，60 ℃温育40 min，待温度降到室温后，于620 nm波长处测吸光值。以浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.3 模拟体外消化环境研究不同浓度汉麻籽多肽结合胆酸盐能力

1.3.3.1 人工胃液的配制

按《中国药典》2010版[19]的方法，取稀盐酸16.4 mL,加入800 mL去离子水，再加入10 g胃蛋白酶，摇匀后，加水定容至1 000 mL,冷藏备用。

1.3.3.2 人工肠液的配制

按《中国药典》2010版[19]的方法，称取磷酸二氢钾6.8 g,用去离子水500 mL溶解，用0.1 mol/mL氢氧化钠调节pH至6.8，另取10 g胰酶加水溶解，将两液混合后，加水稀释至1 000 mL,冷藏备用。

1.3.3.3 不同浓度的多肽结合胆酸盐[20]的能力。称取一定质量的汉麻籽蛋白，按照1∶10料液比加入蒸馏水溶解，加入3.0%的中性蛋白酶，0.4%的木瓜蛋白酶，酶解pH为5.0，酶解温度为70 ℃，酶解时间为3 h。酶解结束后，将酶解液进行水浴(95 ℃)灭酶。将酶解得到的汉麻蛋白酶解液进行分离纯化，制备汉麻籽多肽液。量取不同浓度(0、25、50、75、100、125 mg/mL)汉麻籽多肽溶液1 mL，加入0.5 mL人工胃液，于37 ℃恒温水浴锅中振荡消化1 h 。用0.1 mol/mL氢氧化钠调节pH至6.8，加入2 mL人工肠液，于37 ℃恒温水浴锅中振荡消化 1 h 。分别加入2 mL(2 mg/mL)的胆酸盐，于37 ℃恒温水浴锅中振荡1 h。 8 000 r/min 离心10 min。准确移取 2 mL上清液，按照胆酸盐的测定中糠醛显色法测定 620 nm 波长处吸光度，由标准曲线确定其胆酸盐的质量浓度。再根据反应前后溶液中胆酸盐的浓度差计算汉麻籽多肽对胆酸盐的吸附量。

吸附率=(P1-P2)/P1×100%

式中：P1为胆酸盐溶液的初始质量浓度/mg/mL；P2为吸附后胆酸盐溶液的质量浓度/mg/mL。

1.3.4 不同分子质量汉麻籽多肽降血脂作用研究

量取100 mg/mL不同分子质量的汉麻籽多肽溶液1 mL，加入0.5 mL人工胃液，于37 ℃恒温水浴锅中振荡消化1 h。用0.1 mol/mL氢氧化钠调节pH至6.8，加入2 mL人工肠液，于37 ℃恒温水浴锅中振荡消化 1 h。分别加入2 mg/mL的胆酸盐2 mL，于37 ℃恒温水浴锅中振荡1 h。 8 000 r/min 离心10 min。准确移取2 mL上清液，按照胆酸盐的测定中糠醛显色法测定 620 nm 波长处吸光度，由标准曲线确定其胆酸盐的质量浓度。再根据反应前后溶液中胆酸盐的浓度差计算汉麻籽多肽对胆酸盐的吸附量。根据多肽吸附胆酸盐能力，筛选出降血脂最强的多肽组分。

1.3.5 降脂较强的汉麻籽多肽组分的分子质量分布测定

采用MALDI-TOF基质辅助激光解析飞行时间质谱仪进行分子质量分布测定，取降血脂最强的多肽组分样品复溶于0.1% TFA(三氟乙酸)/30%CAN(乙腈)水溶液中，离心取上清1 μL 点至样品靶上，自然干燥后，再取1 μL CHCA 基质溶液点至对应靶位上并自然干燥，用相同方法在样品靶位相邻靶位上点校准标准品(4 700 Proteomics Analyzer Calibration Mixture 1)。

采用校准标准品Calibration Mixture 1 进行外标一级校准，质量误差小于0.5 u；采集图谱条件：反射扫描模式一级质谱(MS)扫描范围：100～4 000m/z，每张谱图累加500 个Laser Shots。

1.3.6 降脂较强的汉麻籽多肽组分的氨基酸序列分析

采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)[21]对降脂较强的多肽组分进行氨基酸序列分析

1.3.6.1 脱盐

样品(降血脂最强的汉麻多肽组分)用1 mL 0.1%TFA复溶；C18柱内加入1 mL乙腈，洗脱； C18柱内加入1 mL 0.1%TFA水，洗脱； C18柱内加入样品，洗脱； C18柱内加入1 mL 0.1%TFA水，抽干，重复一次；换1.5 mL新收集管，加入1 mL 70%ACN/0.1%TFA，洗脱， 洗脱液冻干。

1.3.6.2 高效液相色谱

液相A液为0.1%甲酸水溶液，B液为0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈为84%)。色谱柱0.15 mm×150 mm (RP-C18)(Column Technology Inc.)以95%的A液平衡。样品由自动进样器上样到Zorbax 300SB-C18 peptide traps，再经色谱柱分离，相关液相梯度为：0～50 min，B液线性梯度从4%到50% ；50～54 min，B液线性梯度从50%到100% ；54～60 min，B液维持在100%。

1.3.6.3 ESI 质谱鉴定[22]

酶解产物经毛细管高效液相色谱脱盐及分离后用Q Exactive质谱仪进行质谱分析。检测方式：正离子。多肽和多肽的碎片的质量电荷比每次全扫描后采集10个碎片图谱。

1.3.6.4 ESI质谱数据分析

原始文件用Mascot 2.2软件中的de nava算法分析。相关参数为:Enzyme=none、Variable modification：Oxidation(M)，Peptides tolerance：20 ppm，MS/MS tolerance：0.1 u，Mascot结果过滤参数为：FDR≤0.01。

2 结果与分析

2.1 胆酸盐标准曲线的建立

采用糠醛显色法，根据不同浓度胆酸盐测得的吸光度值绘制标准曲线。

胆酸钠的线性回归方程为y=0.281 7x+0.006 6，相关系数R2=0.996 4；

甘氨胆酸钠的线性回归方程为y=2.235 5x+0.071 5，相关系数R2=0.997 2；

牛黄胆酸钠的线性回归方程为y=0.701 2x+0.044 2，相关系数R2=0.998 7，都具有较好的线性关系。

2.2 不同质量浓度的汉麻籽多肽结合胆酸盐的能力

模拟体外消化道环境，研究不同质量浓度(0、25、50、75、100、125 mg/mL)汉麻籽多肽结合胆酸盐的能力。分别吸取各浓度的汉麻籽多肽溶液1 mL，加入0.5 mL人工胃液，于37 ℃恒温水浴锅中振荡消化1 h。用0.1 mol/mL氢氧化钠调节pH至6.8，加入2 mL人工肠液，于37 ℃恒温水浴锅中振荡消化1 h。分别加入2 mL(2 mg/mL)的胆酸盐，于37 ℃恒温水浴锅中振荡1 h。 8 000 r/min 离心10 min。准确移取 2 mL上清液，按照胆酸盐的测定中糠醛显色法测定 620 nm 波长处吸光度，计算汉麻籽多肽对胆酸盐的吸附率。

实验结果如图1所示，汉麻籽多肽质量浓度0～100 mg/mL之间，随着浓度的增加，多肽对3种胆酸盐的吸附率逐渐增大；当质量浓度达100 mg/mL时，多肽对3种胆酸盐的吸附率达到最大值，对胆酸钠、甘氨胆酸钠、牛黄胆酸钠的吸附率分别为80.1%、57.3%、28.1%；汉麻籽多肽浓度100～125 mg/mL之间，随着浓度的增加，多肽对3种胆酸盐的吸附率逐渐降低。

图1 不同浓度汉麻籽多肽结合胆酸盐能力

2.3 不同分子质量汉麻籽多肽各个组分结合胆酸盐能力

将汉麻籽多肽酶解液经8 000 r/min，离心15 min，收集上清液。采用切向流过滤系统，对酶解汉麻籽多肽的混合液进行分离，采用超滤膜(截留分子质量为1、3、5 ku)对混合液进行分离，得到4种不同分子质量的多肽组分，采用真空冷冻干燥机制备不同分子质量汉麻多肽冻干粉。各个组分和分子质量范围如表1所示。吸取不同分子质量的汉麻籽多肽(100 mg/mL)，模拟体外消化环境，研究不同分子质量多肽对胆酸盐的结合能力，实验结果如图2所示。不同分子质量的汉麻籽多肽各组分对3种胆酸盐都具有吸附作用，其中组分H4的对胆酸盐的吸附能力大于其他3个组分，对胆酸钠、甘氨胆酸钠、牛黄胆酸钠吸附率分别为86.08%、57.25%、26.87%，研究结果表明汉麻籽多肽组分H4(<1 ku)中具有较强降血脂活性。

图2 不同分子质量汉麻籽多肽各组分结合胆酸盐能力

2.4 降脂较强的多肽组分氨基酸序列分析

2.4.1 降脂较强的多肽组分H4(<1 ku)分子质量分布

采用MALDI-TOF基质辅助激光解析飞行时间质谱仪进行分子质量分布测定，取 1 μL 多肽样品(<1 ku)点至样品靶上，自然干燥后，再取 1 μL CHCA 基质溶液点至对应靶位上并自然干燥，用相同方法在样品靶位相邻靶位上点校准标准品 (4 700 Proteomics Analyzer Calibration Mixture 1)。采用校准标准品 Calibration Mixture 1 进行外标一级校准，质量误差小于0.5 u；采集图谱条件：一级质谱(MS)范围：100～5 000m/z，每张谱图累加 500 个 Laser Shots。从H4分子质量分布质谱图中可以看出，H4肽段分布丰富，肽段主要集中在400～850 u，其中丰度较高的5个肽段为815.4、733.4、655.3、574.3、513.2 u。

2.4.2 采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行氨基酸序列分析

根据多肽组分H4(<1 ku)的分子质量分布，采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术，对815.4、 733.4、655.3、574.3、513.2 u的5个峰值较高的肽段进行序列分析，多肽序列分析结果及质谱图如表2及图3～图7所示。5个氨基酸序列中疏水性氨基酸含量较高，并且均含有疏水性氨基酸—亮氨酸，而且5个氨基酸序列末端的氨基酸均是疏水性氨基酸(缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸)。活性肽降血脂活性与其疏水性氨基酸的含量有关[23]。郑睿[24]从亚麻籽中分离出4种能显著抑制胆固醇胶束溶解度的多肽，4种多肽的氨基酸序列中含有苯丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、酪氨酸、异亮氨酸等疏水性大于10的氨基酸。Lwami等[25]发现疏水性较强的大豆肽对胆酸盐的吸附能力较强，并可促进胆固醇的排出。Kagawa等[26]采用酸性蛋白酶对大豆蛋白进行酶解，研究疏水性氨基酸含量高的水解产物可有效的降低血清 TG 含量。刘健敏等[27]研究发现，大豆肽链的 C-末端为亮氨酸残基，与降胆固醇活性可能有密切的联系。因此，推断汉麻籽多肽的降血脂活性可能与其氨基酸序列中的疏水性氨基酸含量、组成有关，特别是与其含有的亮氨酸密切相关。

表2 汉麻肽段氨基酸序列分析结果

图3 815.4 u肽段序列质谱图

图4 733.4 u肽段序列质谱图

图5 655.3 u肽段序列质谱图

图6 574.3 u肽段序列质谱图

图7 513.2 u肽段序列质谱图

3 结论

不同分子质量的汉麻籽多肽各组分对3种胆酸盐都具有吸附作用，其中组分H4(<1 ku)对胆酸盐的吸附能力大于其他3个组分，具有较强的降血脂活性。采用质谱分析对汉麻降脂活性最强组分H4(<1 ku)丰度较高的5个峰对应的肽段815.4、 733.4、655.3、574.3、513.2 u进行序列测定，氨基酸序列分别为NNGDSPLV、MLPLLF、ELAPLL、SLLEL、LSFF。5个序列中均含有疏水性氨基酸亮氨酸，而且5个氨基酸序列末端的氨基酸均是疏水性氨基酸缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸。本研究通过对不同分子质量汉麻籽多肽结合胆酸盐能力及降脂肽(<1 ku)氨基酸序列分析，推断汉麻籽多肽降血脂活性与其分子质量大小及疏水性氨基酸组成有关，特别是与序列中的亮氨酸密切相关。