RCCS模拟微重力环境对人胃黏膜上皮GES-1细胞代谢组学的影响

郭 松，陈正阳，杨佳启，柴韶斌，徐冰心，孙宏伟，周金莲，杨鹤鸣，崔 彦

外太空是一个集失重、辐射、高磁场、超低温等因素的复杂环境，充斥着威胁航天员生命与健康的不稳定因素。随着载人航天事业的飞速发展，微重力环境对机体的影响备受关注[1-2]。研究证实，微重力环境会对消化系统产生一系列不良影响，包括对消化液和消化道激素分泌、胃肠黏膜屏障、肠道微生态、胃肠道血液及淋巴循环、药物动力学、药物效应动力学及对肝脏、胰腺功能的影响等。保障航天员在执行航天任务及进行模拟微重力环境训练过程中消化系统的稳定状态，明确微重力环境对消化系统影响的机制，均亟待深入研究[3-4]。本课题在前期研究[5-7]的基础上，应用旋转式细胞培养系统(rotary cell culture system， RCCS)，研究模拟微重力环境对人胃黏膜上皮GES-1细胞代谢组学的影响，以期为未来基于微重力环境下代谢组学变化特征探讨胃黏膜上皮相关疾病的发生发展机制及应对措施提供理论基础。

1 材料与方法

1.1主要材料和仪器 人胃黏膜上皮GES-1细胞系(赛百慷生物技术股份有限公司)，RCCS(Synthecon，USA)，10 ml高截面纵横比容器-D410(Synthecon，USA)，Cytodex-3微载体(Sigma，USA)，TCP-SP5-Ⅱ激光共聚焦显微镜(Leica Microsystems，Wetzlar，GER)，超高效液相色谱串联飞行时间质谱仪(AB SCIEX，USA)。

1.2GES-1细胞培养和实验分组 配制含10%胎牛血清，1%青霉素100 U/ml和链霉素100 mg/ml的DMEM培养基，选取3～10代处于对数生长期的人胃黏膜上皮GES-1细胞进行培养。将培养后的人胃黏膜上皮GES-1细胞随机分为模拟微重力组(SMG组)和正常重力对照组(NG组)。

1.3RCCS模拟微重力细胞培养 将人胃黏膜上皮GES-1细胞以1×106个/ml密度与经磷酸缓冲盐溶液(PBS)、75%乙醇预处理的Cytodex-3微载体0.05 g混合，置入高截面纵横比容器-D410并连接RCCS。SMG组的高截面纵横比容器-D410轴心与地面平行，NG组于正常重力环境中培养，转速设置为12 r/min。

1.4样本采集 细胞培养1、3和5 d收集样本。SMG组用5 ml注射器吸取高截面纵横比容器-D410中的混合液体于15 ml离心管内，待细胞-微载体复合物沉淀后弃去上清液，用PBS溶液冲洗细胞-微载体复合物2遍，弃去上清液，随后加入0.25%胰酶消化液2 ml，37℃消化5 min，1000 r/min离心5 min，用吸管吹打，使微载体上的细胞脱落，用70 μm细胞筛过滤，获取单细胞悬液。NG组弃上清液，用PBS溶液冲洗2遍，后加入0.25%胰酶消化液2 ml，37℃消化5 min，获取单细胞悬液。将2组单细胞悬液1000 r/min离心5 min，弃上清液，用液氮速冻后置-80℃冰箱待测。每组样本进行6次生物学重复。

1.5样品处理 取等量细胞样品，加入提取液(甲醇︰乙腈︰水=2︰2 ︰ 1)1000 μl；经高通量组织破碎仪破碎(-20℃，60 Hz)，涡旋(30 s)混匀后，低温超声萃取10 min，重复3次，超声萃取参数为5℃、40 kHz；再将样品静置于-20℃环境中30 min，在4℃、13 000 r/min条件下离心15 min，取上清液，复溶液(乙腈︰水=1︰1)100 μl复溶，转移至超高效液相色谱串联飞行时间质谱仪进样小瓶中上机进行检测。

1.6LC/MS检测 分析平台为超高效液相色谱串联飞行时间质谱仪，色谱条件：色谱柱BEH C18柱(100 mm×2.1 mm i.d，1.7 μm)，流动相A为水(含0.1%甲酸)，流动相B为乙腈/异丙醇(1/1)，设定流速为0.40 ml/min、进样量为20 μl、柱温为40℃。样品质谱信号采集分别采用正负离子扫描模式，离子喷雾电压。样本洗脱梯度见表1，质谱源参数及碰撞能见表2。

表1 流动相洗脱梯度

表2 质谱源参数及碰撞能

1.7数据分析 将原始数据导入代谢组学处理软件Progenesis QI进行基线过滤、峰识别及积分，保留时间校正、峰对齐，得到保留时间、质荷比和峰强度的数据矩阵，进行数据预处理：保留至少一组样品中非零值80%以上的变量；原始矩阵中最小值填补缺失值；总峰归一化，删除QC样本相对标准偏差>30%的变量，获取用于后续分析的数据矩阵。Progenesis QI搜库鉴定，将质谱信息与代谢数据库进行匹配。主要数据库为http://www.hmdb.ca/和https://metlin.scripps.edu。

1.8统计学方法 应用主成分分析(principal component analysis, PCA)，R2X>0.5说明PCA模型效果好，预测能力强。应用正交偏最小二乘判别分析(partial least squares discrimination analysis, OPLS-DA)探讨组间差异。变量重要性(VIP)评价自变量在解释因变量时作用的重要性，筛选VIP>1的变量作为差异代谢物或潜在标志物。采用t检验结合多元OPLS-DA分析，筛选出2组间差异代谢物(同时满足VIP>1，P<0.05)。

2 结果

2.1PCA分析 采用PCA建立模型，对样本进行PCA分析，培养1、3、5 d的2组样本模型参数分别为R2X=0.712、R2X=0.692、R2X=0.624，3个时间点R2X均>0.5。培养1、3、5 d样本的PCA分析得分见图1，2组不同培养时相分别聚类，每组的椭圆分离，表明模拟微重力环境对人胃黏膜上皮GES-1细胞的代谢产生影响；代谢物之间分离聚类，表明代谢物可作为潜在的生物标志物。

图1 旋转式细胞培养系统对模拟微重力环境下人胃黏膜上皮GES-1细胞主成分分析图

2.2OPLS-DA分析 对培养细胞样本进行OPLS-DA分析，结果显示，培养1、3、5 d的2组样本模型参数分别为R2Y=0.919、Q2=0.892，R2Y=0.957、Q2=0.944，R2Y=0.946、Q2=0.933,3个时间点模型参数均>0.5。培养1、3、5 d的2组代谢产物聚类明显分离，见图2，表明代谢产物有明显差异。对样本进行置换检验，以进一步检验OPLS-DA模型的预测性能，见图3。经200次置换检验，得出R2=0.6018，Q2=-0.2192，数值均<1，表明模型稳定，预测性良好。

图2 旋转式细胞培养系统对模拟微重力环境下人胃黏膜上皮GES-1细胞正交偏最小二乘判别分析

图3 旋转式细胞培养系统对模拟微重力环境下人胃黏膜上皮GES-1细胞正交偏最小二乘判别分析置换检验结果

2.3差异代谢物筛选 对2组1、3、5 d的代谢产物采用多元OPLS-DA分析结合t检验，筛选出202种差异代谢物，2组培养1 d有151种差异代谢物，其中113种表达上调，38种表达下调；2组培养3 d有134种差异代谢物，其中109种表达上调，25种表达下调；2组培养5 d有154种差异代谢物，其中131种表达上调，23种表达下调。

2.4差异代谢物分析 将2组差异代谢物数据进行代谢物分析，通过Venn图筛选出2组1、3、5 d的共同差异代谢物(VIP>1且P<0.05)74种，其中57种表达上调，17种表达下调，见图4。通过KEGG数据库，发现有具体名称及相关功能的差异代谢物44种，主要包括磷脂、氨基酸、辅助因子及羧酸，见图5。通过HMDB数据库，发现这些代谢物的亚分类主要包括甘油磷脂酰胆碱(21.74%)、甘油磷脂酰乙醇胺(19.57%)、氨基酸及肽类(17.39%)等，见图6。KEGG数据库富集通路分析结果显示，差异代谢物涉及脂类代谢、氨基酸代谢、辅酶和维生素代谢、神经递质代谢、碳水化合物代谢、细胞增殖和凋亡、肿瘤调控、膜转运、信号传导等信号通路，见图7。44种差异代谢物中31种表达上调，13种表达下调。磷脂类中磷脂酰胆碱有4种表达上调，2种表达下调；磷脂酰乙醇胺有5种表达上调，1种表达下调；磷脂酰甘油有2种表达上调；磷脂酰丝氨酸有2种表达下调；溶血磷脂共9种，表达皆上调；鞘脂类中鞘磷脂表达下调，鞘氨醇和鞘氨醇半乳糖表达上调，见表3。

表3 培养1、3、5 d人胃黏膜上皮GES-1细胞共同差异代谢物

图4 培养1、3、5 d人胃黏膜上皮GES-1细胞共同差异代谢物Venn图

图5 培养1、3、5 d人胃黏膜上皮GES-1细胞差异代谢物KEGG数据库化合物分类

图6 培养1、3、5 d人胃黏膜上皮GES-1细胞差异代谢物HMDB数据库化合物分类

图7 培养1、3、5 d人胃黏膜上皮GES-1细胞差异代谢物KEGG数据库富集通路分析

3 讨论

GES-1细胞系为原代培养的胎儿正常胃黏膜上皮细胞,经过SV40病毒感染并经转化分离后建立的可在体外长期稳定传代的细胞系。除了良好的转化特性外，GES-1细胞还保留了正常的细胞骨架结构，如微丝、微管、角蛋白，其黏蛋白反应阳性，以单层形式贴壁生长，可以在体外长期传代，是一种比较理想的研究人胃黏膜正常上皮细胞的体外模型细胞[8-9]。

代谢组学作为系统生物学的重要组成部分，可对生物体内广谱代谢产物进行定量分析并发现不同状态下代谢产物的变化，从而明确生物体不同代谢产物与相应生理、病理状态的关系，目前已广泛应用于生命科学各领域，为诠释生命现象、探寻疾病机制、研发药物、发现生物学标志物等提供了强大的技术平台，展现了崭新的理论视角[10]。

本实验应用代谢组学研究发现，RCCS模拟微重力环境对人胃黏膜上皮GES-1细胞的代谢产生明显影响，其中对于脂质代谢物及脂质代谢通路的影响尤为显著。模拟微重力环境使人胃黏膜上皮GES-1细胞的溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰乙醇胺、硬脂酰肉碱等表达增加，而鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰单甲基乙醇胺、油酰胺等表达减少。现已明确，这些脂类代谢物是构成细胞膜结构的主要成分，与其稳定性和发挥正常功能密切相关。磷脂酰胆碱是构成细胞膜结构的主要成分，而溶血磷脂酰胆碱在膜上发挥溶解作用。溶血磷脂酰丝氨酸可诱导胃腔分泌型磷脂酶A2活性增加,其产物溶血磷脂酰胆碱能够直接破坏胃的疏水层，并且可能导致胃屏障的破坏和炎症的发生[11-12]。本课题组前期研究RCCS模拟微重力环境对人角化细胞及表皮干细胞代谢组学的影响，同样发现模似微重力环境导致细胞的多种脂质代谢失调，并涉及细胞的氨基酸代谢通路、膜转运通路及脂质代谢通路等[13-14]。细胞膜结构包括细胞膜、内质网膜、高尔基体膜、核膜、线粒体膜、溶酶体膜等，均以磷脂双分子层为基本骨架。暴露于微重力环境中的细胞膜结构变化，早年即引起学术界的关注，但相关机制一直未能明确[15-16]。郭彪等[5]进行尾悬吊模拟失重大鼠实验，发现失重可导致胃黏膜超微结构改变及氧化应激损伤，持续尾悬吊可导致胃黏膜细胞膜脂质过氧化损伤，超微结构异常，胃黏膜层变薄，分泌及屏障功能受损。结合文献分析认为，微重力环境下人胃黏膜上皮GES-1细胞脂质代谢发生变化，影响细胞膜结构的稳定性，达到一定阈值将导致膜屏障功能受损、细胞内环境紊乱、物质和能量交换及信息传递障碍、药物代谢受影响[17]等一系列问题。

本研究结果还提示，在RCCS模拟微重力环境中人胃黏膜上皮GES-1细胞的增殖、分化、凋亡发生变化。代谢物变化包括PE(18∶1(11Z)/15∶0)表达增加；SM(d18∶0/16∶1(9Z))表达减少，而其代谢产物Sphingosine和Galactosylsphingosine表达增加；L-谷氨酸、D-色氨酸、酪氨酸、酪氨酰色氨酸、赖氨酰缬氨酸、谷胱甘肽、2-(S-谷胱甘肽)乙酰基谷胱甘肽、L-异亮氨酸和缬氨酸等氨基酸类化合物表达亦增加。KEGG数据库富集通路分析亦显示，模拟微重力环境中人胃黏膜上皮GES-1细胞的差异代谢物涉及细胞增殖和凋亡通路。已有研究证实，人和哺乳类动物的质膜中富含磷脂酰乙醇胺，其已成为细胞凋亡分子检测研究的重要目标[18]。鞘脂是一类具有广泛生理功能和病理作用的脂类物质，而鞘磷脂为细胞鞘脂的主要成分，在细胞的质膜结构和细胞功能方面发挥重要作用，受鞘磷脂代谢通路调控，参与细胞的增殖、生长、凋亡及炎症修复[19-20]。据Zhu等[21]研究报道，回转器模拟微重力环境使胃癌SGC-7901细胞72 h时凋亡增加，胃黏膜上皮HFE-145细胞在12 h时凋亡即显著增加。显然，在微重力这一极为特殊的环境刺激下，机体细胞会发生一系列应激反应，而凋亡变化则为一种普遍存在的生理/病理现象，在应激反应和代偿/失代偿生物学过程中发挥重要作用[22]。中长期微重力环境对胃黏膜上皮细胞增殖、分化和凋亡的影响及机制尚待进一步研究。

本研究还发现，肿瘤和炎症相关联的代谢物亦发生变化。胃肠道肿瘤和炎性细胞含有活化的鞘脂代谢酶，包括鞘氨醇激酶1和鞘氨醇激酶2，它们会产生具有高生物活性的鞘氨醇-1-磷酸，一般炎症反应与循环鞘氨醇-1-磷酸有关，肿瘤患者血浆和淋巴中多存在高浓度的鞘氨醇-1-磷酸[23]。模拟微重力环境下人胃黏膜上皮GES-1细胞的鞘磷脂等代谢异常，有可能影响细胞的精细功能包括肿瘤性转化[24]。我们研究发现，模拟微重力环境下人胃黏膜上皮GES-1细胞发生SM表达下调的同时，Sphingosine和Galactosylsphingosine表达上调。据文献报道，Sphingosine和Galactosylsphingosine定位于脂质筏并扰乱膜的完整性，且可抑制蛋白激酶C向质膜的转运[25]。KEGG数据库富集通路分析结果显示，模拟微重力环境中人胃黏膜上皮GES-1细胞的差异代谢物同样涉及肿瘤调控通路。微重力环境对肿瘤的影响，已引起学术界的重视[26]。本课题组前期进行模拟微重力对人HGC-27胃癌细胞的研究，代谢组学分析显示，RCCS模拟微重力环境主要影响人HGC-27胃癌细胞的脂质代谢，同时发现RCCS模拟微重力环境下人HGC-27胃癌细胞的增殖、细胞周期和超微结构发生显著变化。显然，微重力环境下人HGC-27胃癌细胞在代谢组学水平和超微结构层面发生了重要变化[6-7]。故探讨微重力环境下机体细胞的肿瘤性转化特点抑或观察微重力环境对肿瘤细胞的影响，对丰富航天医学基础理论、为航天员长期驻留太空提供医学保障均具有重要意义。