阿托伐他汀钙对糖尿病大鼠骨骼肌musclin、myonectin mRNA表达的影响

董雪琪，高 燕

骨骼肌是人的运动器官，负责运动和体热的产生。近年研究证实，骨骼肌具有内分泌功能并能合成、分泌多种肌肉因子，通过自分泌、旁分泌、内分泌的方式参与机体葡萄糖和脂肪酸代谢[1-3]。多种肌肉因子被认为是预防2型糖尿病等慢性代谢性疾病的重要因素[4-5]。musclin作为骨骼肌细胞特异性分泌的多肽蛋白质，受营养条件和激素尤其是胰岛素的调控参与细胞对葡萄糖的摄取和利用，与胰岛素抵抗、2型糖尿病的发生存在一定关系[6-7]。myonectin又称补体C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白15，是骨骼肌分泌的一种新型生物活性物质[8]，其表达量与血脂、血糖水平显著相关[9]。本实验应用高糖高脂、2型糖尿病大鼠模型，观察高糖高脂下musclin、myonectin mRNA的表达及阿托伐他汀钙干预对其表达的影响，以探讨阿托伐他汀钙对骨骼肌糖代谢影响的可能机制。

1 材料与方法

1.1实验动物与饲料 SPF级雄性Wistar大鼠50只，8周龄，体质量180～220 g，动物许可证号：SCXK(鲁)20140007,动物合格证号：37009200014560。于动物实验室适应性喂养1周，饮食、进水自由。动物饲料购于北京博泰宏达生物技术有限公司。

1.2造模、分组及给药 将50只大鼠随机分为空白对照组(n=10)、高糖高脂组(n=20)、糖尿病组(n=20)。空白对照组大鼠给予普通饲料喂养，高糖高脂组及糖尿病组大鼠给予高糖高脂饲料喂养。4周后，糖尿病组大鼠予链脲佐菌素(STZ)40 mg/kg腹腔注射，余2组注射等体积枸橼酸盐缓冲液。注射1周后监测糖尿病组大鼠空腹血糖(FPG)，FPG≥11.1 mmol/L即造模成功。造模成功后，将高糖高脂组及糖尿病组大鼠分别随机分为高糖高脂模型组、高糖高脂治疗组、糖尿病模型组、糖尿病治疗组，每组各10只大鼠。高糖高脂治疗组、糖尿病治疗组在高糖高脂饲料喂养的同时，给予阿托伐他汀钙8.4 mg/kg灌胃，余3组使用同等剂量0.9%氯化钠注射液灌胃，共6周。

1.3骨骼肌标本的采集和处理 6周干预后，所有大鼠禁食、水12 h,于次日分批腹腔注射10%的水合氯醛溶液麻醉，麻醉成功后分离后肢骨骼肌组织，取部分骨骼肌组织迅速放入液氮罐中冷冻，取材完毕统一转移置-70℃冰箱中保存，用于反转录聚合酶链式反应检测。另留取部分骨骼肌组织置于10%福尔马林液中固定，用于HE染色显微镜下形态学观察。

1.4myonectin、musclin mRNA实时定量聚合酶链式反应检测 取适量骨骼肌组织样本加入Trizol 1 ml充分裂解后加入三氯甲烷200 μl，混匀、离心后收集上清，转移至新1.5 ml EP管中；加入等体积的异丙醇，充分混匀后离心，弃上清；加入75%乙醇，充分混匀离心；倒掉酒精，晾干，加入DEPC 40 μl水溶解RNA。使用超微量核酸蛋白测定仪检测RNA纯度，A260/A280比值为1.8～2.0。采用Aidlab公司生产的反转录试剂盒对提取的RNA进行反转录，得到cDNA，-80℃保存。以β-actin为内参基因行反转录聚合酶链式反应，反应条件：95℃ 3 min、95℃ 10 s、60℃ 30 s，共39个循环。引物信息见表1。以β-actin为内参，利用2-ΔΔCt计算各样品基因相对表达量。

表1 引物信息

2 结果

2.1各组大鼠光镜下骨骼肌组织形态学比较 空白对照组大鼠光镜下骨骼肌肌纤维大小一致，粗细均匀，未见细胞核内移。模型组、治疗组大鼠骨骼肌组织较空白对照组大鼠均出现退行性改变。与空白对照组大鼠相比，高糖高脂模型组及糖尿病模型组大鼠骨骼肌肌纤维大小不一，有核内移，肌纤维分裂。与模型组大鼠相比，高糖高脂治疗组及糖尿病治疗组大鼠骨骼肌虽有肌纤维大小不一、核内移、肌纤维分裂等变化，但损伤较小，核内移比例较低，肌纤维粗细相对一致。见图1。

图1 5组大鼠光镜下骨骼肌组织形态学比较(HE×200)

2.2各组大鼠骨骼肌musclin、myonectin mRNA表达水平比较 与空白对照组大鼠相比，高糖高脂模型组和糖尿病模型组大鼠骨骼肌musclin、myonectin mRNA表达水平均显著上调(P<0.05)；高糖高脂治疗组与高糖高脂模型组大鼠相比musclin、myonectin mRNA表达水平明显降低，但与空白对照组大鼠比较表达水平明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；糖尿病治疗组与糖尿病模型组大鼠比较，musclin、myonectin mRNA表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，但与空白对照组大鼠比较表达水平明显增高(P<0.05)。见表2。

表2 5组大鼠骨骼肌中musclin myonectin mRNA表达水平比较

3 讨论

随着饮食结构的变化，人们日常摄入糖类、脂类物质比例增加，2型糖尿病的患病率逐年上升，成为继肿瘤和心血管疾病后第三大威胁健康的慢性疾病[10-11]。糖尿病发病的主要机制为胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能损伤，分子水平方面主要与葡萄糖转运体及胰岛素信号传导通路相关[12-13]。胰岛素抵抗主要发生在骨骼肌、肝脏和脂肪组织中[14]。骨骼肌作为人体重要的内分泌器官可分泌多种生物活性因子，在预防肥胖、胰岛素抵抗和相关疾病(包括2型糖尿病)中起重要作用[15]。

musclin作为肌源性分泌因子与肌肉组织的葡萄糖摄取、脂肪酸代谢、胰岛素抵抗状态紧密关联[16-17]。研究证实，在胰岛素诱导分化的C2C12细胞中musclin表达显著上调[7]。PI3K/AKT途径是促进葡萄糖转运蛋白-4(GLUT-4)跨膜转运重要的胰岛素信号传导通路[18]。musclin能够下调胰岛素诱导大鼠分化的成肌细胞模型中PI3K和AKT/PKB mRNA的表达，减弱GLUT-4活性，从而抑制葡萄糖摄取及糖原合成[19]。AKT/FOXO1信号传导通路处于胰岛素信号传导通路下游，是调节糖原合成并维持葡萄糖稳态的重要途径，能够有效改善胰岛素抵抗[20]。而FOXO1作为PI3K途径的下游因子，可下调musclin mRNA的表达[20]。本研究显示，与空白对照组大鼠相比，糖尿病模型组、高糖高脂模型组大鼠骨骼肌musclin mRNA表达明显上调，进一步证明musclin可以降低PI3K、AKT/PKB mRNA的表达，抑制GLUT-4活性及细胞对葡萄糖的摄取。而阿托伐他汀钙则能显著降低高糖高脂治疗组大鼠骨骼肌中musclin mRNA的表达，但对糖尿病治疗组无显著影响，提示阿托伐他汀钙对糖尿病早期的调节作用可能是通过抑制musclin的表达以调控胰岛素信号传导通路，来维持葡萄糖和脂肪酸在营养状态下的代谢平衡。

myonectin作为一种在骨骼肌中特异性表达的肌源性分泌因子，介导骨骼肌与肝脏、脂肪等器官或组织之间的“对话”，其表达水平受机体营养状况影响[21]。Seldin等[8]对隔夜禁食小鼠分别用葡萄糖和脂肪乳剂进行灌胃，结果证明二者均能诱导myonectin水平升高。在跑台运动对高脂饮食大鼠myonectin表达影响的研究中同样证实，高脂饲养可显著升高骨骼肌中myonectin mRNA的表达水平，而运动则明显降低肥胖大鼠骨骼肌中myonectin mRNA的表达水平[9]，提示机体血糖、血脂的升高可促进骨骼肌中myonectin mRNA的表达。相关临床研究发现，新发2型糖尿病患者血浆myonectin水平较正常人显著升高，且血浆myonectin水平与胰岛素抵抗程度呈正相关[22]。本实验结果表明，高糖高脂状态引发myonectin mRNA表达大幅上升，因此可以推断myonectin可能作为一种代谢感应因子参与胰岛素抵抗，在高糖高脂状态下代偿性增高。但阿托伐他汀钙可明显下调高糖高脂治疗组myonectin mRNA的表达，而对糖尿病治疗组myonectin mRNA的表达无明显影响，说明阿托伐他汀钙能改善糖尿病前期糖脂代谢，这可能是通过对myonectin水平的调控影响胰岛素抵抗来实现的。

综上，糖尿病早期阿托伐他汀钙可经下调musclin、myonectin mRNA表达进一步调控PI3K/AKT通路，改善胰岛素抵抗，调节糖代谢水平。提示临床应尽早使用阿托伐他汀钙对糖尿病患者进行干预。