异甘草酸镁对肺纤维化大鼠的保护作用及机制研究

高 瑕，冯 同，李万成

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是一种临床上常见的以中老年人群发病为主的间质性肺疾病，发病率约为10/10万，病因及发病机制目前尚不清楚，临床预后差[1]。近年来，IPF发病率呈明显上升趋势，引起了世界各国的高度关注[2-5]。IPF的主要临床表现为进行性呼吸困难加重，晚期可出现咳嗽、咳痰、乏力、消瘦，因缺乏有效治疗药物，5年生存率低于50%，患者最终多死于呼吸衰竭[6-7]。目前，临床治疗IPF仍以糖皮质激素为主，但疗效欠佳，且长期使用存在严重的毒副作用[8-9]，因此应用受限。吡非尼酮作为抗纤维化的新型药物，可有效抑制肺功能下降、改善患者呼吸困难症状，但此药物也因价格昂贵，并且具有较大的肝毒性、光毒性等不良反应[10-11]，导致临床应用较少。因此，明确IPF的发病机制及寻找一种可有效作用于该机制靶点的药物就显得极为迫切。近来研究表明中药类制剂甘草酸在肺纤维化防治方面起重要作用[12]。异甘草酸镁(MgIG)是一种肝细胞保护剂，为第四代甘草酸制剂[13]，Yang等[14]研究发现在放射性肺纤维化模型中，MgIG表现出较好的抗纤维化作用。但目前关于MgIG对博来霉素诱导肺纤维化大鼠的治疗作用报道甚少，因此本实验通过气管内注射博来霉素来构建肺纤维化大鼠模型，旨在研究MgIG对层黏连蛋白(LN)、透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、转化生长因子-β1(TGF-β1)及羟脯氨酸(Hyp)表达的影响，探索MgIG对肺纤维化的保护作用机制，以期为临床防治肺纤维化找到新的思路。

1 材料与方法

1.1实验动物 24只8～10周成年、雄性SPF级健康SD大鼠，体质量(200.0±20.0)g，由成都达硕实验动物有限公司提供。大鼠在通风良好、光照适宜、温度和湿度合适的环境中适应性饲养1周。

1.2主要试剂 博来霉素(成都梓诚奕博生物科技有限公司生产)，MgIG注射液(正大天晴药业集团股份有限公司生产)，HE染色试剂盒(武汉Boster生物工程有限公司生产)，Masson染色试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司生产)，LN、HA、Hyp检测试剂盒(南京建成生物工程研究所生产)，PCⅢ检测试剂盒(上海康朗生物科技有限公司生产)，TGF-β1检测试剂盒(上海钰博生物科技有限公司生产)。

1.3主要方法

1.3.1动物模型制备：将预先备好的大鼠随机分为对照组、模型组、干预组，每组8只。标准饲养1周后将大鼠称重，10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉大鼠。将大鼠的头部及四肢用皮筋固定于操作台上，碘伏棉球消毒大鼠颈部皮肤，在无菌操作下切开颈部皮肤1～2 cm，止血钳逐层钝性分离组织，充分暴露气管。模型组及干预组大鼠用1 ml注射器穿刺向气管内注射博来霉素溶液(5 mg/kg)，对照组大鼠于气管内注入等量0.9%氯化钠注射液。注射后立即将大鼠上下、左右旋转5 min，使药物尽可能均匀分布于肺部。

1.3.2药物干预：肺纤维化大鼠模型构建成功后24 h，干预组大鼠腹腔注射MgIG注射液30 mg/(kg·d),余2组每日腹腔注射等量0.9%氯化钠注射液，连续干预28 d。

1.3.3标本采集：大鼠血清标本采集：10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，固定于操作台上，消毒、备皮，切开腹腔，取腹主动脉近心端全血4 ml，室温静置2 h后置入离心机中3000 r/min离心15 min，取上清液于-80℃环境保存备用，待全部血清采集完毕后按照各检测试剂盒要求进行操作。肺组织标本采集：切开大鼠胸骨，结扎气管，取大鼠全肺，用0.9%氯化钠注射液清洗、滤纸擦净肺表面多余水分后称重，计算肺系数(肺湿质量/肺体质量)，并将左肺下叶组织固定于4%多聚甲醛中，放置于4℃冰箱中至少24 h后行组织脱水、石蜡包埋、切片(厚度约3 μm)，再行HE染色、Masson染色后显微镜下观察。参照Szapiel等[15]方法对肺泡炎及肺纤维化程度进行评分，无肺泡炎为0分、肺泡炎面积<20%为1分、肺泡炎面积20%～50%为2分、肺泡炎面积>50%为3分，无纤维化为0分、纤维化面积<20%为1分、纤维化面积20%～50%为2分、纤维化面积>50%为3分。取右肺下叶组织保存于-80℃冰箱用于Hyp含量测定。

1.3.4肺组织Hyp含量测定：取100 mg新鲜大鼠右肺下叶组织，加入组织裂解液1 ml，震荡混匀，于100℃水中水解20 min；取4 ml反应试剂，混匀(注意全程pH维持在6.0～6.8)，高温水浴锅中静置20 min后取出，放置室温中待自然冷却后离心15 min，取上清液于波长550 nm处测定其吸光度值，并计算Hyp含量。

2 结果

2.1大鼠肺组织大体改变 对照组：肉眼观大鼠肺组织形态正常，表面光滑、湿润，呈粉红色，弹性较好。模型组：与对照组比较，肺组织体积明显缩小，表面凹凸不平，缺血面积大，呈暗红色，弹性差。干预组：肺组织大体形态介于对照组及模型组之间，体积稍缩小，表面较红润，局部凹凸不平、有散在出血点，弹性欠佳。

2.2大鼠肺组织病理学改变

2.2.1肺组织HE染色：对照组：大鼠肺组织肺泡形态、结构均完整，肺泡间隔清晰可见，无充血、水肿，几乎无炎性细胞浸润及纤维渗出。模型组：肺泡壁结构断裂，肺泡形态结构破坏明显，肺泡腔内见大量炎性细胞及胶原纤维渗出。干预组：肺泡结构部分破坏，较多炎性细胞及胶原纤维渗出，但程度较模型组轻。见图1。

图1 3组大鼠肺组织HE染色所示(×100) 对照组为未造模大鼠组，模型组为肺纤维化大鼠组，干预组为异甘草酸镁干预的肺纤维化大鼠组

2.2.2肺组织Masson染色：对照组：大鼠肺组织肺泡结构清晰，形态结构正常，有极少许蓝色胶原纤维沉积。模型组：大鼠肺组织形态、结构破坏明显，镜下见大量蓝色胶原纤维沉积。干预组：大鼠肺泡组织结构部分破坏、融合，见较多胶原纤维沉积，相较模型组蓝色胶原纤维面积有所减少，纤维化程度有所减轻。见图2。

图2 3组大鼠肺组织 Masson染色所示(×100) 对照组为未造模大鼠组，模型组为肺纤维化大鼠组，干预组为异甘草酸镁干预的肺纤维化大鼠组

2.3大鼠肺系数、肺泡炎评分、肺纤维化评分比较 与对照组大鼠比较，模型组和干预组大鼠肺系数、肺泡炎评分、肺纤维化评分均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；相较模型组大鼠，干预组大鼠上述指标均有所下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组大鼠肺系数、肺泡炎评分、肺纤维化评分

2.4大鼠血清肺纤维化指标比较 与对照组大鼠比较，模型组和干预组大鼠血清LN、HA、PCⅢ含量均明显增加(P<0.05)；相较模型组大鼠，干预组大鼠血清LN、HA、PCⅢ含量均有所下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组大鼠血清肺纤维化指标比较

2.5大鼠血清TGF-β1含量比较 与对照组大鼠比较，模型组和干预组大鼠血清TGF-β1含量明显增加(P<0.05)；与模型组大鼠比较，干预组大鼠血清TGF-β1含量明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 3组大鼠血清TGF-β1含量比较 对照组为未造模大鼠组，模型组为肺纤维化大鼠组，干预组为异甘草酸镁干预的肺纤维化大鼠组；TGF-β1为转化生长因子-β1；与对照组比较，aP<0.05;与模型组比较，cP<0.05

2.6大鼠肺组织Hyp含量比较 与对照组大鼠比较，模型组和干预组大鼠肺组织Hyp含量明显增加(P<0.05)；与模型组大鼠比较，干预组大鼠肺组织Hyp含量有所下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 3组大鼠肺组织Hyp含量比较 对照组为未造模大鼠组，模型组为肺纤维化大鼠组，干预组为异甘草酸镁干预的肺纤维化大鼠组；Hyp为羟脯氨酸；与对照组比较，aP<0.05;与模型组比较，cP<0.05

3 讨论

IPF是一种病因及发病机制复杂的疾病，主要病理改变为肺泡腔内大量炎性细胞浸润、肺泡间隔断裂和肺间质纤维化[16-18]。研究表明，气管内注入博来霉素诱导的肺损伤动物模型与人肺纤维化改变极其相似，是目前国内外最经典的造模方法[19]。因此，本实验也采用气管内注射博来霉素来诱导肺纤维化模型，肺组织病理结果显示：肺泡形态结构破坏明显，肺泡壁结构断裂，肺泡腔内见大量炎性细胞渗出及大量蓝色胶原纤维沉积，表明本实验构建的肺纤维化大鼠模型是成功的。

MgIG是第四代甘草酸提取物，于21世纪初应用于临床，是单一构型的18α-甘草酸制剂，与一代、二代、三代甘草酸提取物比较，具有肠道吸收好、疗效佳、不良反应小、安全性高、肝脏靶向性高等优点，被广泛用于肝炎和肝纤维化的治疗[20]。近来研究表明，MgIG可有效减轻百草枯中毒导致的肺损伤及放射性肺纤维化[21-22]。

TGF-β1由淋巴细胞、上皮细胞、单核细胞及成纤维细胞等多种细胞产生，是转化生长因子-β家族中的一种亚型[23]，在机体免疫、损伤修复、基质形成等过程中起重要作用。TGF-β1是目前公认的最强的致纤维化细胞因子，其激活与疾病的发生发展有着密切的关系[24]。研究发现，在博来霉素诱导肺纤维化模型中，TGF-β1的表达显著升高，而进行药物干预后TGF-β1表达下调，且小鼠炎症反应及纤维化程度得到明显改善，提示TGF-β1在肺纤维化中起着重要作用[25-26]。本实验结果显示，TGF-β1在模型组中水平升高，而在干预组中水平较模型组降低，提示MgIG可下调博来霉素诱导的肺纤维化大鼠模型中TGF-β1的表达。

Hyp是胶原纤维特有的氨基酸，在肺纤维化组织中的表达明显增强，是反映肺纤维化程度的重要指标[27]。LN是构成细胞外基质的一种非胶原糖蛋白，由内皮细胞、上皮细胞产生，与胶原一起构成基底膜成分，其是细胞黏着于基质的介质，调节细胞的生长与分化。研究发现，在博来霉素诱导的肺纤维化大鼠模型中，LN表达较对照组明显升高，提示LN参与了肺纤维化形成过程[28]。HA是一种酸性黏多糖，主要由成纤维细胞分泌产生，广泛分布于细胞外基质，是细胞外基质的主要成分之一。研究表明，在间质性肺疾病患者中HA水平升高[29]，提示HA也参与了肺纤维化的形成。PCⅢ作为Ⅲ型胶原的前体，也是组成细胞基质的重要成分，其血清含量反映了胶原纤维合成及代谢情况[30-31]。在IPF患者血清中发现，PCⅢ水平较对照组显著升高，其可作为评估肺纤维化严重程度的重要指标[32]。本实验结果提示，在博来霉素诱导的肺纤维化大鼠模型中，Hyp、LN、HA、PCⅢ水平较对照组升高，故再次证明本实验肺纤维化模型的构建成功，这也为临床诊断肺纤维化提供了可靠的指标。

综上，MgIG可能通过抑制TGF-β1、LN、HA、PCⅢ、Hyp水平进而改善博来霉素诱导大鼠肺泡炎及肺纤维化程度。