基于网络药理学和分子对接探讨银杏叶治疗高血压病潜在作用机制

刘翠翠，杨 晨，杨 涛，朱俊豪，庄钰金，颜 军*，余 能

1成都大学药学院 四川抗菌素工业研究所 药食同源植物资源开发四川省高校重点实验室，成都 610052；2成都农业科技职业学院，成都 611130；3成都晶富医药科技有限公司，成都 610041

高血压是一种以体循环动脉压升高为特征的慢性心血管疾病，可导致心、脑、肾等器官损伤，同时，也将大幅增加人们患有冠心病、动脉粥样硬化等心脑血管疾病的概率[1]。随着人口老龄化加剧，我国高血压及其导致的心脑血管疾病的患病率不断增加，高血压防治已成为我国公共卫生的一项严峻挑战[2]。从高血压临床表现来看，中医学将其归属于“肝风”、“头痛”、“眩晕”等病症范畴[3]，并分为肝火亢盛、痰湿壅盛、阴虚阳亢、阴阳两虚4个证型，治疗时因人施治、辨证论治[4]。银杏叶作为银杏的药用部位之一，其主要有效成分有黄酮类、萜内脂类、银杏酸类化合物[5]，具有调节血脂、改善脑血流、抑制血小板活性、抗衰老、抗凋亡等多种药理作用[6]。目前，银杏叶制剂已成为治疗心脑血管疾病植物药品种之一[7]，已有多种银杏叶制剂(如：银杏叶片、银杏酮酯、舒血宁注射液、银杏达莫注射液等)应用于临床。同时，临床上使用西药和银杏叶制剂对高血压患者联合用药结果显示，两种药物的降压效果优于单纯服用降压药，但银杏叶制剂降压的成分和机制尚不明确[8]。运用“药物-靶点-通路-疾病”之间的相互作用网络来揭示多分子药物协同作用于疾病的机制的网络药理学与中医学的整体观以及中药及其复方多成分、多途径、多靶点协同作用的原理殊途同归[9]。由此，该文采用网络药理学方法对银杏叶治疗高血压的潜在机制与作用网络展开了研究，以便为银杏叶制剂的临床应用与研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 网站数据库和分析软件

中药系统药理学分析平台TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)；蛋白数据库UniProt(http://www.uniprot.org/)；靶点预测平台Swiss Target Prediction平台(http://www.swisstargetprediction.ch/)；OMIM数据库(https://omim org)；GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)；DrugBank数据库(https://www.drugbank.ca/)；STRING数据库(https://string-db.org/)；DAVID平台(https://david.ncifcrf.gov/)；微生信网络平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)；PDB数据库(http://www.rcsb.org/)；ZINC数据库(https://zinc.docking.org/)；Cytoscape 3.7.2软件；AutoDock分子模拟软件及Pymol。

1.2 主要化学成分及作用靶点的收集与筛选

银杏叶成分检索数据库选用TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)；候选化合物筛选条件为化合物药动学参数中类药性(drug-like，DL)≥0.18且口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%；运用TCMSP数据库检索候选化合物靶点并通过蛋白质数据库(UniProt)将其转化为相应的基因；运用Swiss Target Prediction平台(http://www.swisstargetprediction.ch/)预测候选化合物潜在靶点。最后合并TCMSP与Swiss Target Prediction数据库检索到的化合物靶点并剔除重复基因，即得药物作用的靶点基因。

1.3 高血压病相关基因的收集

将“hypertension”作为检索关键词，在OMIM数据库(https://omim org)、GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、DrugBank数据库(https://www.drugbank.ca/)中进行高血压病靶点的检索并删除重复基因。

1.4 网络的构建与分析

1.4.1 成分靶点网络的构建

取化合物的预测靶点与高血压相关靶点的交集，即得到银杏叶治疗高血压的预测靶点。然后，在Cytoscape 3.7.2软件中构建其成分靶点网络，并以节点表示化合物、靶蛋白，边表示化合物-靶点的相互作用。运用Cytoscape软件的“Network Analyzer”功能分析成分靶点网络的拓扑属性，计算节点的紧密度(closeness)、介度(betweenness)、连接度(degree)3个重要参数并据此分析银杏叶治疗高血压的主要活性成分。

1.4.2 构建靶蛋白相互作用网络

借助STRING数据库(https://string-db.org/)构建靶蛋白相互作用网络(PPI)，将“物种”设置为“Homo sapiens”、“最低相互作用阈值”设置为“中等置信度>0.4”，其余参数均保持默认。然后，运用Cytoscape软件分析PPI网络拓扑属性，并筛选其中的关键靶点。

1.5 GO生物过程与KEGG通路富集分析

运用DAVID平台(https://david.ncifcrf.gov/)对银杏叶治疗高血压的关键靶点进行GO、KEGG分析，“物种”选择为“H.sapiens”，预测银杏叶治疗高血压病的潜在作用机制。筛选出P<0.05的生物过程与通路，并根据富集基因的多少排序，将前20位的通路导入微生信网络平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)绘制条形图和气泡图。

1.6 成分—靶点—通路网络构建

结合相关文献筛选、分析富集基因数排名前20的KEGG信号通路，得出可能与高血压相关的信号通路，并找出富集在这些通路上的抗高血压靶点，再与相应的活性成分配对，从而构建“成分-靶点-通路”网络。

1.7 分子对接验证

选取“成分-靶点-通路”网络中“degree”值排名前3的靶点与对应的活性成分进行分子对接，同时以蛋白配体和一线降压药氢氯噻嗪(Hydrochlorothiazide)、呋塞米(Furosemide)为阳性对照，在PDB数据库(http://www.rcsb.org/)中下载靶点的3D结构“.pdb”格式文件，在ZINC数据库(https://zinc.docking.org/)中下载化合物3D结构的“.mol2”格式文件。在AutoDock Tools(v1.5.6)中导入靶点的3D结构经过去水、加氢、分配电荷等处理，运用Grid模块设置蛋白原配体为对接盒子中心，其格点盒子大小设定为40×40×40，将准备好的蛋白文件、配体文件、化合物文件以及脚本放入相应文件夹，利用Autodock_vina 1.1.2分子模拟软件进行分子对接。然后，用结合能(affinity)来评价化合物与受体的匹配情况，并使用Pymol绘制最佳匹配结果图。

2 结果

2.1 银杏叶主要活性成分的筛选

运用TCMSP数据库检索出307个银杏化学成分，再根据OB≥30%、DL≥0.18的原则，筛选出27个化合物，主要含黄酮类如山柰酚(MOL000422)、槲皮素(MOL000098)、异鼠李素(MOL000354)及木犀草素(MOL000006)和银杏内酯等(见表1)。

表1 银杏叶活性成分及ADME参数

续表1

图1 银杏叶活性成分与交集靶点相互作用网络图Fig.1 Interaction network between active components and intersection targets in GBL注：六边形节点代表活性成分；菱形节点代表靶点。Note:The hexagonal node represents the active component;The rhombic node represents the target.

2.2 药物疾病靶点筛选结果

运用TCMSP、Swiss Target Prediction平台分别检索出470、1 328个潜在靶点，删除成分间重复靶点后分别获得218、354个潜在靶点，将其合并、剔除重复靶点后得到480个潜在靶点。然后，在OMIM、DrugBank、GeneCards三个在线数据库中挖掘出了1 136个高血压相关靶点。至此可知，两个数据集的交集(190个)即为银杏叶治疗高血压的潜在靶点。与筛选出的27个主要活性成分匹配后得到22个具有降压作用的活性成分。

2.3 网络图分析

2.3.1 成分靶点网络

将银杏叶中可能具有降压作用的22个活性成分及190个交集靶点数据导入Cytoscape 3.7.2软件，构建成分靶点网络图，见图1。结果显示，共有212个节点，形成762个关系对。该成分靶点网络degree平均值为7.19，介值中心度(betweenness centrality，BC)平均值为0.009 8，紧密中心度(closeness centrality，CC)平均值为0.34，这表明银杏叶中多成分、多靶点相互作用。靶点数排名前5的成分分别为槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)、异鼠李素(isorhamnetin)、金圣草(黄)素(chryseriol)，揭示这些成分可能是银杏叶治疗高血压的有效成分，拓扑参数见表2。

表2 银杏叶-活性成分-关键靶点-疾病网络拓扑分析

2.3.2 靶蛋白PPI网络分析

在STRING数据库中进行PPI网络分析，设置置信度≥0.4得到187个靶点、形成3 093个蛋白互作关系对，且有3个无蛋白相互作用靶点，见图2。因网络节点“degree”中位数为25，故以“degree”大于等于2倍中位数的值为筛选条件，即“degree≥50”，筛选出44个候选靶点；然后对其进行degree、betweenness以及closeness计算分析，再筛选出大于中位数的靶点，得到20个关键的治疗高血压靶点(见图3)。将这20个靶点与对应成分进行匹配后，按照度值筛选前五位成分为槲皮素、木犀草素、山柰酚、金圣草(黄)素、异鼠李素，与之前得到的靶点数前五的成分一致，说明这五个成分为银杏叶治疗高血压的关键成分。

2.4 GO生物过程和KEGG通路富集分析

运用DAVID 6.8数据库对上文中得到的20个关键治疗高血压靶点进行GO分析，得到248个条目。并且，以P<0.05为筛选条件，筛选出208个有效条目。其中，182个生物过程条目、10个细胞组成条目、16个分子功能条目。图4所示的是筛选出的最低P值的10个条目并将其升序排列的情况。结果显示，生物过程主要涉及一氧化氮生物合成过程的正调控(positive regulation of nitric oxide biosynthetic process)、药物反应(response to drug)、平滑肌细胞增殖的正调控(positive regulation of smooth muscle cell proliferation)及血管生成(angiogenesis)等，细胞组成中主要影响细胞外空间(extracellular space)、细胞外区域(extracellular region)、小窝(caveola)、蛋白质复合物(protein complex)；分子功能主要包括相同蛋白结合(identical protein binding)、酶结合(enzyme binding)、蛋白质结合(protein binding)、细胞因子活性(cytokine activity)等方面。

图2 银杏叶治疗高血压病靶点的蛋白质相互作用(PPI)网络图Fig.2 Protein protein interaction (PPI) network of GBL as a target for the treatment of hypertension

图3 PPI网络筛选Fig.3 PPI network screening注：蓝色代表度值小于50的靶点；红色代表度值大于50的靶点；黄色代表度值大于67、介度大于5.466、紧密度大于0.896的靶点。Note:The blue represents targets with degree value less than 50;The red represents targets with degree value greater than 50;The yellow represents targets with degree value greater than 67,betweenness greater than 5.466,and closeness greater than 0.896.

再对这20个关键靶点进行KEGG信号通路分析并以P<0.05为筛选条件，得到90条信号通路。然后，按P值大小升序排列，前20位的信号通路分别是乙型肝炎(Hepatitis B)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)、Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)等(见图5)。

图4 银杏叶活性成分GO生物过程分析Fig.4 Biological process analysis of active component go in GBL

图5 银杏叶活性成分-靶点KEGG通路富集分析Fig.5 Enrichment analysis of active components target KEGG pathway in GBL

2.5 活性成分-靶点-信号通路网络

从KEGG排名前20的信号通路中筛选出可能与高血压相关的10条，并将其与银杏叶的活性成分、作用靶点一一对应，构建“成分—靶点—通路”多维网络(见图6)。图中度值越大，节点越大，颜色越深。由此分析可得，银杏叶治疗高血压涉及的活性成分共21个，关键成分有槲皮素、山柰酚、木犀草素、异鼠李素、金圣草黄素等，靶点有PTGS2、ATK1、EGFR、TNF等，主要涉及乙型肝炎、TNF信号通路、甲型流感、结核、MAPK信号通路等。

图6 银杏叶活性成分-靶点-信号通路网络Fig.6 Active components target signal pathway network of GBL注：菱形节点为活性成分；箭头节点为靶点；圆形节点为信号通路。Note:Rhombus node is the active component;Arrow node is the target;Round node is signal pathway.

2.6 分子对接结果

选取“成分-靶点-通路”网络中“degree”值排名前3的靶点PTGS2、ATK1、EGFR作为银杏叶治疗高血压的潜在作用靶点，与核心活性成分槲皮素、山柰酚、木犀草素、异鼠李素、金圣草黄素以及蛋白配体、一线降压药氢氯噻嗪、呋塞米进行分子对接(见表3)。一般情况下，对接评分的绝对值越大，化合物与靶点的结合力越强、构象也越稳定。绝对值>4.25时，说明化合物与靶点可能结合；绝对值>5.0时，说明结合能力较高；绝对值>7.0时，说明结合能力高[10]。分子对接结果显示，化合物与靶蛋白的最低结合能都小于0，说明配体与受体可以自发结合。其中金圣草黄素、木犀草素、异鼠李素与PTGS2、ATK1、EFGR等结合能绝对值均大于其他化合物与一线降压药氢氯噻嗪、呋塞米，其中金圣草黄素、木犀草素、异鼠李素与EGFR的结合能绝对值高于蛋白配体，表明其具有强的结合能力。分子对接模式如图7所示。分析表明木犀草素(a)与PTGS2共形成9个氢键，金圣草黄素(b)与PTGS2共形成9个氢键，槲皮素(c)与PTGS2共形成8个氢键，说明活性成分与靶蛋白具有较强的亲和力，且结合体构象稳定。综合分析，槲皮素、山柰酚、木犀草素、异鼠李素、金圣草黄素可能是银杏叶治疗高血压的关键成分。

3 讨论

高血压的危险因素与遗传、年龄、体重、饮食、生活习惯等多种因素相关。中医认为证候要素以阴虚、气虚、痰、血虚等为主，肝与肾脏是受高血压影响的主要靶器官。现代医学认为：高血压的发病机制与肾素-血管紧张素-醛固酮系统、粘附分子和细胞因子表达的增加、水钠潴留、免疫细胞活化和浸润、炎症反应和氧化应激的形成等有关。这些系统或功能长期紊乱，会破坏血管内稳态，使血管平滑肌细胞肥大、血管舒缩功能失调、外周阻力增加等而造成血压升高[11]。

表3 银杏叶活性成分与高血压潜在作用靶点的分子对接结果

图7 分子对接模式图Fig.7 Molecular docking pattern注：a.PTGS2-木犀草素；b.PTGS2-金圣草黄素；c.PTGS2-异鼠李素；d.AKT1-木犀草素；e.AKT1-金圣草黄素；f.AKT1-异鼠李素；g.EGFR-木犀草素；h.EGFR-金圣草黄素；i.EGFR-异鼠李素。Note:a.PTGS2-Luteolin;b.PTGS2- Chryseriol;c.PTGS2-Isorhamnetin;d.AKT1-Luteolin;e.AKT1- Chryseriol;f.AKT1-Isorhamnetin;g.EGFR-Luteolin;h.EGFR-Chryseriol;i.EGFR-Isorhamnetin.

对银杏叶治疗高血压的作用网络与潜在机制的研究结果表明：银杏叶中可能含有21个成分对治疗高血压有显著效果，其中槲皮素、山柰酚、木犀草素、异鼠李素、金圣草黄素为关键成分，银杏内酯等作为协同作用成分。槲皮素和山柰酚等具有显著的心脏相关益处，如抑制LDL氧化、非内皮依赖性血管扩张剂的作用；减少粘附分子和其他炎症标记，在氧化应激条件下对一氧化氮和内皮功能的保护作用；还可预防神经元氧化和炎性损害以及血小板的抗凝集作用[12]。已有研究表明氧化应激是高血压的重要促成因素，并且在高血压肾损害中起着关键作用。银杏内酯具有抗氧化应激作用，提高高血压脑出血治疗效果，对高血压脑出血患者神经功能的恢复具有积极作用[13]，同时，银杏内酯还可协同作用银杏黄酮有效清除过量氧自由基[14]。此外，该文收集到的银杏叶190个治疗高血压的靶点，表明银杏叶治疗高血压不是单一成分或靶点的作用，而是多成分、多靶点协同作用的结果。

从构建的PPI网络可知，银杏叶与高血压靶点存在密切相互作用，核心靶点有20个，主要与PTGS2、AKT1、EGFR、TNF、MMP9、MAPK1、STAT3、EGFR、MMP2、IL6等有关。研究表明，心血管疾病的病理生理和高血压炎症机制的发生与血管、肾脏和血管周围脂肪组织中免疫细胞的浸润息息相关[15]。其中，JUN是AP-1(激活子蛋白-1)的组成之一，而AP-1可诱导炎症因子白介素6(IL6)、白介素10(IL10)、肿瘤坏死因子(TNF)等的表达，引起血管内皮细胞及炎症细胞的增殖，血管阻力增大从而导致血压升高[16]。前列腺素内源性过氧化物合酶(PTGS2)能够激活分布在血小板和内皮细胞上的前列环素受体G蛋白，从而松弛血管平滑肌及抑制血小板聚集，降低血压[17]。VEGFA为血管内皮细胞生长因子，可诱导新血管生成，调节血管张力，在调节病理性血管生成中起着核心作用[18]。血管内皮障碍相关基因MAPK1、AKT1等参与了MAPK信号通路，从而促进血管内皮细胞的增殖与血管生成，并与高血压的发生密切相关[19]。黄酮类成分能有效抑制炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β和VCAM-1的产生，并增强抗氧化能力[20]。同时，银杏叶中的银杏内酯也可降低IL-6、TNF-α、MMP9等炎症因子水平，改善炎症反应[21]。那么，银杏叶极有可能是通过控制炎症反应、改善血管内皮功能障碍，进而起到治疗作用。

进一步对其进行GO分析和KEGG通路分析，GO富集分析显示：银杏叶治疗高血压主要通过对一氧化氮生物合成过程和平滑肌细胞增殖的正调控、血管生成等生物过程发挥作用。KEGG通路富集结果显示，乙型肝炎、TNF信号通路、Toll样受体信号通路、HIF-1通路、MAPK信号通路等是银杏叶降压的主要通路。研究表明：HIF-1α、VEGF信号通路被认为是治疗与血管生成有关的疾病的重要靶标[22]；HIF还可激活控制细胞氧稳态的基因，包括与耗氧、红细胞生成、血管生成和线粒体代谢有关的基因[23]。这正好佐证了GO富集分析结果中影响NO的生物合成与血管生成等生物过程。同时，槲皮素能显著抑制TLR4-NF-κB通路，减少炎症因子释放，从而改善心室重构[24]；木犀草素通过激活Toll样受体4(TLR4)、TNF受体相关因子6(TRAF6)、核转录因子-κB(NF-κB)信号通路，降低了脑出血诱发的细胞因子的释放[25]；银杏内酯可通过抑制IL-1β、TNF等信号通路，从而控制炎症反应、抑制血管内皮细胞凋亡、改善组织血流量[26]。

综上所述，该文系统地分析了银杏叶治疗高血压的作用机制，揭示了银杏叶治疗高血压潜在的活性成分、作用网络和潜在作用机制，证明了银杏叶治疗高血压具有多成分、多靶点、多通路协同作用的特点，为进一步药效物质基础分析和作用机制研究提供方向，其后期需要实验进一步验证相关通路间的关系。