淫羊藿总黄酮通过TGF-β1/Smad3信号通路改善自然衰老大鼠肾脏组织纤维化

盖李乐，袁 丁，张长城，夏宗保，石 越，高 艳，袁成福*

1三峡大学医学院，宜昌 443000；2荆门市第一人民医院，荆门 448000

随着人口老龄化的到来，年龄相关性疾病的发病率呈现出显著增长趋势，经大数据统计，近10年来慢性肾病的患病率已高达10%[1]。肾脏是人体最重要的代谢器官之一，在维持正常的生命活动中起着至关重要的作用。随着年龄增长，衰老所伴随发生的肾小球硬化、肾小管萎缩及肾间质纤维化，使得肾脏结构及血流动力学发生改变，肾功能进行性恶化甚至丧失[2-4]。肾纤维化是慢性肾病的终末期表现，一旦发生，严重影响患者的生活质量以及生存时间，因此，寻找防治衰老相关纤维化的有效药物具有重要的医学价值和社会意义，积极地改善肾脏组织慢性损伤和纤维化，是防治慢性肾病的重要环节。

淫羊藿(Herba Epimedii)又名仙灵脾，是一味常见的传统天然补肾中药，性温，走肝肾二经，具有补肾壮阳、强筋健骨、祛风除湿之功效，其药用历史悠久[5]。淫羊藿总黄酮(total flavonoids of Herba Epimedii，TFE)是淫羊藿的有效成分，现代药理学研究显示，TFE具有改善骨质疏松[6]、心血管疾病[7]、睾丸病变[8]的功效，同时可通过促进细胞增殖、抗氧化、抗炎等多种途径来抵抗衰老[9]，具有较大的研究价值。本课题组前期研究显示，TFE能通过调节IRE1α/XBP1信号通路改善自然衰老大鼠睾丸支持细胞的分泌功能[10]；TFE还可通过抑制MAPK/NFκB信号通路改善自然衰老大鼠的脑部炎症，延缓脑衰老[11]。多项报道显示淫羊藿能够有效抵抗多部位脏器衰老，然而其能否改善肾脏衰老所致的纤维化却鲜有报道。因此，本研究通过观察TFE对自然衰老大鼠肾脏形态、功能以及αSMA、TGFβ1、Smad3蛋白表达水平的影响，来探讨TFE对自然衰老大鼠肾脏组织纤维化的影响及其作用机制，为丰富淫羊藿在衰老相关性疾病的防治提供有力的实验依据。

1 实验材料与仪器

1.1 实验药物

淫羊藿总黄酮购于成都仁诚生物科技有限公司，其纯度为80%，用1%羟甲基纤维素钠(sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na)配置成相应浓度的溶液。

1.2 实验动物

无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级雄性SD大鼠18月龄36只、2月龄10只，购自北京维通利华技术有限公司，合格证号：SCXK(京)2012-0001，分笼饲养于三峡大学实验动物中心SPF级屏障系统，温度22±2 ℃，湿度60%±5%，光照明暗交替，饲养期间大鼠均自由摄食饮水。

1.3 实验试剂

Trizol、逆转录试剂盒、实时定量PCR试剂盒(大连宝生物科技有限公司)；PCR引物(生工生物工程股份有限公司)；SOD试剂盒、MDA试剂盒、Masson染色试剂盒(南京建成生物工程研究所)；β-actin抗体(美国Santa cruz公司)；α平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin，αSMA)抗体(美国Santa cruz公司)；转化生长因子(transforming growth factor-beta，TGF-β)抗体(美国Abcam公司)；Smad3抗体(美国CST公司)。

1.4 实验仪器

MICROM GmbHHM340E超薄切片机(德国MICROM)；StepOnePlusTM实时定量PCR仪(美国Applied Biosysterms)；TYPE1500-458全波长酶标仪(美国Thermo Electron)；PowerPacTMBasic电泳仪(美国Bio-Rad)；Bioshine ChemiQ4800化学发光成像自动显影仪(中国欧翔科学仪器有限公司)。

2 实验方法

2.1 实验分组及处理

将36只18月龄雄性SD大鼠适应性喂养一周后，随机分为3组：自然衰老组、TFE低剂量组(10 mg/kg)、TFE高剂量组(40 mg/kg)，每组12只，10只2月龄大鼠为青年对照组。每日定时给予大鼠灌胃1次，共计给药4个月。根据大鼠体重，TFE低、高剂量组给予相对应浓度的药物灌胃，青年对照组及自然衰老组分别给予体重相对应的1% CMC-Na溶液灌胃，每周称量一次体重，根据体重调整灌胃容量。

2.2 肾脏组织的收集及保存

大鼠喂养4个月后，在取材前称量大鼠体重；麻醉后用脱颈法处死，组织剪沿皮肤及皮下组织各层剖开胸腹腔，迅速摘取大鼠肾脏等组织，用预冷的PBS清洗后滤纸吸干多余液体，一部分肾脏组织过液氮后冻存在-80 ℃，另一部分肾脏纵行切开后浸泡于4%多聚甲醛用于HE染色和免疫组化实验。

2.3 HE染色和Masson染色观察肾脏组织形态和胶原沉积

肾脏标本用4%多聚甲醛固定，脱水后石蜡包埋，切片用二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水，经苏木精和伊红染色(HE staining)后在光学显微镜下观察肾脏病理改变，Masson染色评估肾脏组织胶原沉积情况。在200倍镜下每张切片随机选取5个不同视野，呈现蓝色的区域为胶原纤维，蓝色区域的面积与整个视野总面积的比值为肾脏纤维化指数。采用Image Pro Plus 6.0软件进行半定量分析。

2.4 检测肾脏组织SOD活力及MDA含量

称取100 mg肾脏组织，加入1 mL预冷的PBS缓冲液制备成10%匀浆，用冰冻离心机4 ℃ 3 500 rpm离心15 min，吸取上清液，按照试剂盒步骤，分别采用黄嘌呤氧化酶法和TBA法检测肾脏组中的SOD活力和MDA含量。

2.5 Real-time PCR检测mRNA表达水平

称取40 mg肾脏组织，加入Trizol充分裂解，再依次加氯仿、异丙醇、75%乙醇抽提RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，核酸仪检测RNA浓度，经逆转录得到cDNA。反应体系为：SYBR 5 μL，超纯水3.4 μL，引物0.4 μL(上、下游引物各0.2 μL)，Dye 0.2 μL，cDNA 1 μL，在ABI StepOneplusTM仪器进行扩增，反应条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，共40个循环。每个样本2个复孔，以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCT计算出目的基因相对表达量。

表1 PCR引物序列

2.6 免疫组化法检测大鼠肾脏组织αSMA的表达

肾脏组织石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化，柠檬酸盐修复液高压修复10 min，PBS冲洗后滴加3%过氧化氢37 ℃孵育10 min，再PBS冲洗，用5% BSA室温下封闭1 h，滴加一抗(1∶200)4℃孵育过夜后滴加二抗，室温孵育1 h，PBS冲洗3遍，用DAB显色液显色，苏木精复染、盐酸酒精分化后，自来水冲洗，干燥后封片。镜下观察到阳性表达呈现棕黄色，在200倍镜下随机选取5个不同视野，用Image Pro Plus 6.0软件分析阳性表达的相对面积。

2.7 Western blot检测肾脏组织TGF-β1及Smad3的蛋白水平表达

称取40 mg肾脏组织，加入裂解液高速研磨30 s，涡旋仪振荡15 s，冰上静置10 min，重复3次，4 ℃下12 000 rpm离心15 min，用BCA法测定蛋白浓度，加入上样缓冲液煮沸10 min。制备SDS-PAGE凝胶，电泳并转印至PVDF膜上，5%牛奶室温下封闭1 h，4 ℃下一抗孵育过夜，TBST洗膜后在室温下孵育二抗1 h，洗膜后用ECL化学发光液显影。

2.8 统计学方法

3 实验结果

3.1 TFE对自然衰老大鼠肾脏组织病理形态的影响

如图1HE染色图片所示，与青年对照组相比，自然衰老组大鼠肾脏肾小球血管袢增生，肾小管扩张，广泛炎性细胞浸润，局部有点片状萎缩坏死，大量胶原纤维增生；而与自然衰老组相比，TFE低、高剂量组大鼠肾脏组织中肾小管扩张程度减轻，炎性细胞数量减少，胶原纤维明显减少，形态结构明显改善。

3.2 TFE对自然衰老大鼠肾脏组织胶原沉积的影响

由图2 Masson染色可见，肾脏组织中肾小球上皮细胞胞浆、间质细胞胞浆等呈红色，胶原纤维呈蓝色。与青年对照组比较，自然衰老组胶原纤维明显增多(P< 0.05)，而TFE组肾脏组织中的胶原纤维较自然衰老组减少，且高剂量组效果显著(P< 0.05)。

3.3 TEF对自然衰老大鼠肾脏组织SOD活力的影响

如图3所示，与青年对照组相比，自然衰老组SOD活力显著下降，而MDA的含量在自然衰老组大鼠肾脏组织中明显上升(P< 0.05)，TFE组较自然衰老组SOD活力升高，MDA含量用药后下降，且高剂量组有统计学意义(P< 0.05)。

3.4 TFE对自然衰老大鼠肾脏组织TGF-β1、Smad3 mRNA表达的影响

如图4所示，与青年对照组相比，自然衰老组TGF-β1、Smad3 mRNA表达明显增加(P< 0.05)，而TFE组较自然衰老组显著降低(P< 0.05)。

图1 HE淫羊藿总黄酮对肾脏组织形态的影响(× 200)Fig.1 The effects of TFE on morphology of kidney slice of rats (× 200 )注：箭头所示为炎性细胞浸润。A：青年对照组；B：自然衰老组；C：淫羊藿总黄酮低剂量组；D：淫羊藿总黄酮高剂量组(下同)。Note:The arrows indicate inflammatory cell infiltration.A is the young contro groupl;B is the natural aging group;C is the low-dose group of TFE;D is the high-dose group of TFE (the same below).

图2 淫羊藿总黄酮对肾脏组织胶原纤维沉积的影响Fig.2 The effects of TFE on collagenous fiber in kidney slice of rats s,n = 9-11 )注：与青年对照组比较，*P< 0.05；与自然衰老组比较，#P < 0.05(下同)。Note:Compared with young control group,*P< 0.05;Compared with natural aging group,#P < 0.05 (the same below).

3.5 TFE对自然衰老大鼠肾脏组织αSMA蛋白表达的影响

如图5免疫荧光结果所示，与青年对照组相比，自然衰老组肾脏αSMA阳性表达明显增加(棕黄色部分)(P< 0.05)，而经TFE给药组较自然衰老组降低，且高剂量组效果更为显著，具有统计学意义(P< 0.05)。

3.6 TFE对自然衰老大鼠肾脏组织TGF-β1、Smad3蛋白表达的影响

如图6所示，与青年对照组相比，自然衰老组TGF-β1、Smad3蛋白表达明显增加，TFE组较自然衰老组明显降低(P< 0.05)。

图3 淫羊藿总黄酮对大鼠肾脏SOD活力和MDA含量的影响Fig.3 The effects of TFE on SOD vitality and the content of MDA in kidney of rats s,n = 9-11 )

图4 淫羊藿总黄酮对肾脏组织中TGF-β1和Smad3的mRNA水平的影响Fig.4 The effects of TFE on the mRNA level of TGF-β1 and Smad3 in kidney s,n = 9-11)

图5 淫羊藿总黄酮对肾脏组织中αSMA蛋白表达的影响 Fig.5 The effects of TFE on the protein expression of αSMA in kidney s,n = 9-11 )

4 讨论

目前，我国老年人占总人口数的百分比已高达17%，老龄化是慢性肾脏疾病的主要因素之一，且老年患者并发症的发生率也成倍增长，肾脏疾病的发生及发展将严重威胁到老年人口的生存时间和质量[12]。因此，探寻有效的干预措施,对慢性肾病患者的转归有一定的改善作用，而对于衰老过程而言，预防肾脏衰老可能是防治老年性肾脏疾病的途径之一。

图6 淫羊藿总黄酮对肾脏组织中TGF-β1/Smad3信号通路中蛋白表达的影响Fig.6 The effects of TFE on the protein expression of TGF-β1 and Smad3 in kidney s,n = 9-11 )

肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis，RIF)是多种慢性肾脏疾病发展到终末期的一种病理表现，也是衰老肾脏的主要表现之一和导致肾衰竭的主要原因之一[13]。肾小管上皮细胞表型转分化是肾间质纤维化发生的核心环节，αSMA作为一种高度特异性的转分化标记物，是纤维化发生的标记物之一[14]。通过HE染色和Masson染色可以观察到，自然衰老大鼠肾脏组织中的胶原纤维明显增多，免疫组化显示αSMA表达量显著升高，给予不同浓度淫羊藿总黄酮灌胃处理后，肾脏组织中胶原纤维含量减少，αSMA表达量下降，且高剂量组效果显著，表明TFE能通过减少胶原纤维的产生而改善肾间质纤维化。

随着年龄的增加，抗氧化能力逐步下降，机体自由基的产生和消除能力失衡，氧自由基不断蓄积，导致细胞的损伤，功能下降[15,16]。SOD是一种抗氧化酶，以自由基为底物，与O2结合生成H2O2，是清除体内氧自由基的主要物质[17]。氧自由基通过诱发多不饱和脂肪酸的过氧化形成MDA等脂质过氧化物，引起细胞损伤。MDA含量可反映机体内脂质过氧化程度，与SOD共同反映抗氧化能力。本研究实验结果显示，与青年大鼠相比，自然衰老大鼠肾脏组织中SOD活力明显下降，MDA含量升高，而给予淫羊藿总黄酮灌胃组的大鼠SOD活力较模型组增加，MDA含量下降。这说明衰老大鼠的抗氧化能力下降，而给予TFE灌胃后抗氧化能力较之提升。

伴随着衰老的发生，机体代谢的代偿能力逐渐衰弱，细胞受到代谢产物的刺激后活化，产生一系列炎性因子，从而诱导炎性细胞的产生和浸润[18]。我们通过HE染色还可以观察到，衰老大鼠肾脏组织中有广泛炎性细胞浸润，淫羊藿总黄酮处理组中的炎性浸润明显减少，说明淫羊藿总黄酮能通过减轻炎性细胞浸润起到保护肾脏的作用。这与前期夏世金[19]、韩桂芳[20]等研究报道的淫羊藿总黄酮的抗炎作用相似。

TGF-β是一种强致肾小球硬化和肾纤维化的细胞因子[18]，其主要通过促进炎性细胞的募集和活化，介导肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化以及促进细胞外机制的合成与沉积[21,22]。Smad蛋白是TGF-β受体的胞内激酶底物[23]，作为TGF-β信号的重要中介，它能够通过TGF-β的早期靶基因的DNA结合特征域，直接激活编码转录调控因子和信号转导的基因。因此，TGF-β/Smad信号通路在慢性肾纤维化损伤进程中起着重要作用[23]。这说明找到针对TGF-β1这一靶点的有效药物，有极大可能改善纤维化进展。在本项研究中，自然衰老大鼠肾脏组织中TGF-β1和Smad3的mRNA及蛋白水平均明显升高，而给予TFE灌胃处理后降低，且高剂量效果显著。这提示淫羊藿总黄酮可能通过抑制TGF-β1的表达，减少Smad3的表达，起到改善肾脏组织纤维化的作用。

综上所述，TFE具有改善自然衰老SD大鼠肾脏纤维化的作用，其可能机制与降低自然衰老大鼠肾脏组织中TGF-β1、Smad3和αSMA的蛋白表达水平有关，以及通过减少炎性细胞浸润、减轻氧化应激对肾脏造成的损伤，从而改善衰老肾脏纤维化。目前已有研究证实淫羊藿总黄酮在多部位脏器中具有抗炎、抗氧化、抗衰老等作用，但尚未有研究报道其在肾脏组织中具有改善衰老所致的纤维化作用，而肾脏组织是机体代谢的重要参与者，因此，本研究具有一定的创新性和应用价值，为淫羊藿在衰老肾脏纤维化等相关一系列疾病的临床防治中的应用提供了实验基础和应用依据。