吸入性肺炎患者肺泡灌洗液中核苷酸结合寡聚化结构域2、核因子-κB的表达及其临床意义

陈秀兰

吸入性肺炎（Aspiration pneumonia，AP）好发于长期卧床、留置鼻饲管的老年患者，由于老年患者咽部肌肉松弛，吞咽功能下降，咳嗽反射减弱，常合并多种基础疾病，不重视日常护理很容易导致鼻腔分泌物、口腔分泌物、胃内容物反流入气道，往往会引发肺部感染，尤其是右肺病变明显[1]。AP 治疗难度较大、费用高，不及时控制很容易引发急性呼吸衰竭、重症肺炎、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）等严重的呼吸系统疾病，是导致老年患者死亡的常见原因之一。因此，在临床中要注意保持患者呼吸道通畅，及时清除气道分泌物，预防各种反流物吸入，以预防AP 发生[2]。本研究通过观察AP患者肺泡灌洗液（BALF）中核苷酸结合寡聚化结构域2（Nucleotide binding oligomerization 2，NOD2）mRNA、核因子-κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）mRNA表达情况，同时检测下游炎症因子白介素-6（IL-6）、超敏C反应蛋白（hs-CRP）水平，进一步探讨NOD2和NF-κB 在AP患者致炎中的作用。

1 材料与方法

1.1 一般资料选择2018年1月～2019年10月在我院住院的肺炎患者90例，分为吸入性肺炎组（AP组）和非吸入性肺炎组（非AP组），AP组患者40例，男23例，女17例，年龄56～89岁，平均（70.5±16.98）岁，病程1～12周，平均（7.93±1.72）周；非AP组患者50例，男28例，女22例，年龄52～84岁，平均（68.7±14.62）岁，病程5d～11周，平均（7.14±1.53）周。两组基线资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

纳入标准：①胸部CT提示片状浸润性阴影或间质性改变，双肺病变多见，大部分位于下叶，且以胸膜下为主；②有明确误吸史或存在与误吸相关的多个危险因素；③有以下临床症状之一：白细胞和中性粒细胞计数升高，发热，咳嗽、咳痰，肺部啰音和（或）肺实变体征[3]。排除标准：①存在影响白细胞计数的非感染相关性疾病；②发生肺部感染后生存时间≤24h；③合并其他系统感染。

1.2 标本处理留取BALF 4ml，2 500r/min 离心10min，将BALF 转移至新的EP 管，按Trizol 一步法提取总RNA，加20µl 无RNA 酶的水溶解，按照Takara 公司逆转录试剂说明书要求合成cDNA，标本于-80℃条件下保存。

1.3 RT-PCR法检测NOD2 mRNA 和NF-κB mRNA表达每组取1ml BALF 悬液，加入200µl 的Trizol裂解液中，提取总RNA，并按照逆转录试剂说明书逆转录为cDNA，NOD2、NF-κB 和β-actin 引物序列见表1。

扩增PCR反应体系，反应条件：94℃预变性1min30s；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，循环40次；最后72℃延伸5min。每份标本3个复孔，复孔间CT值差异小于0.5，以β-actin 为内参，CT值减去内参的CT值作为△CT，以2-△△CT表示目的基因的表达量。所有标本重复3次，并计算各组均值。

表1 依据GenBank 序列设计引物

1.4 ELISA法检测hs-CRP 和IL-6水平严格按照人hs-CRP 和IL-6 的ELISA 试剂盒说明书进行操作，取OD值作为纵坐标，标准品作为横坐标，根据检测结果绘制标准曲线。根据各孔测定的OD值在标准曲线中得出hs-CRP 与IL-6 水平。

1.5 统计学方法采用SPSS 19.0 软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t检验。采用ROC曲线分析NOD2、NF-κB 用于诊断AP的敏感度和特异度。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组NOD2 mRNA、NF-κB mRNA表达水平比较AP组NOD2 mRNA、NF-κB mRNA表达水平（7.46±1.82、39.12±9.53）明显高于非AP组（3.38±0.65、12.13±3.76），差异有统计学意义（t=11.252、9.734，P=0.013、0.024）。

2.2 两组炎症因子水平比较AP组IL-6、hs-CRP水平[（23.72±6.54）ng/ml、（17.38±4.42）mg/L] 高于非AP组[（14.37±4.67）ng/ml、（7.35±2.86）mg/L]，差异有统计学意义（t=13.522、12.038，P=0.009、0.015）。

2.3 NOD2和NF-κB诊断AP的ROC曲线分析NOD2和NF-κB 诊断AP的ROC曲线下面积分别为0.734、0.789，二者对AP 均具有诊断价值（P＜0.05），见表2，图1。

表2 NOD2 和NF-κB 诊断AP的ROC曲线分析

图1 NOD2 和NF-κB 诊断AP的ROC曲线

3 讨论

NOD2是一种经典的细胞质内识别受体，在机体中起着重要的桥接作用，介导各种呼吸道炎症疾病的致炎过程[4]。NF-κB 由P50 蛋白亚基与P60蛋白亚基共同构成，属于一种多向性调节功能的核转录因子，在细胞中起着承上启下的致炎作用，尤其在炎症性疾病中的表达更为突出；NOD2 作为模式受体，也是上游细胞因子，在整个致炎通路中可激活NF-κB，促进炎症介质在肺间质内的滞留蓄积、转运及活化，NOD2 还可以通过氧化应激反应来调控NF-κB的分泌[5]。

NOD是核苷酸结合寡聚化结构域家族成员中的一个分支，其主要包括NOD1 和NOD2，均属于细胞内蛋白。该受体主要介导参与机体的固有免疫，与机体炎性疾病关系较密切，在各种免疫炎性反应中发挥重要的调控作用；尤其是被活化的NOD2，活化后可介导炎症通路的多种信号途径，并且可以释放一系列的促炎细胞因子[6]。激活后的NOD2 可定位于细胞质外膜，从而启动炎症通路中下游因子NF-κB 活化，促进IL-6、PCT、TNF 及干扰素等多种炎症因子分泌，还具有增强血小板粘附、趋化、聚集等功能，特别是在血栓性疾病中也起着重要作用[7]。贾钦尧等[8]发现慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者外周血NOD2 mRNA 和NF-κB mRNA 水平明显高于对照组，证实NOD2、NF-κB 参与COPD 的致炎过程。NF-κB 主要的生物学功能是基因调控，特别是炎症相关基因的转录，正常情况下NF-κB 与IκB 结合，以非活性形式存在于组织的巨噬细胞浆中，在炎症刺激后IκB 开始发生磷酸化，进而NF-κB 与其解离并激活相应基因，从而参与AP的免疫反应和炎症反应[9]。本研究显示AP组患者BALF 中NOD2 mRNA、NF-κB mRNA表达水平明显高于非AP组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

NOD2 在应激、炎症和免疫等异常反应状态下可表达于外周血中，参与固有免疫的细胞凋亡和炎症反应[10]。NOD2 介导的信号通路可激活NF-κB，启动调节急性应激反应，诱导下游炎症因子（如TNF-α、IL-6 与hs-CRP 等）分泌，加重组织损伤，其表达量与疾病的严重程度相关[11]。IL-6、hs-CRP是机体重要的炎症因子，可用于疾病诊断、病情判断及预后评估，本研究结果显示AP组炎症指标IL-6、hs-CRP水平与非AP组比较均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。急性炎症状态下的AP患者IL-6 与hs-CRP水平高于非AP患者，说明炎症因子增加是AP的病理因素。

本研究采用ROC曲线分析NOD2 和NF-κB 诊断AP的价值，曲线下面积分别为0.734、0.789，二者对AP 均具有诊断价值，将NOD2受体定量水平及下游炎症因子NF-κB水平作为预测指标具有一定的临床价值。但本研究样本量较小，需要更大样本量的研究进一步证实。AP患者NOD2、NF-κB水平与炎症活化指标之间的量化关系及机制值得深入探讨。