微生物谷氨酰胺转氨酶的来源与生物工程技术研究进展

张秀江，权淑静，向凌云，刘 丽，解复红，冯 菲，胡 虹*

（1.河南省科学院生物研究所有限责任公司，河南 郑州 450008；2.河南省工业酶工程技术研究中心，河南 郑州 450008）

谷氨酰胺转氨酶（transglutaminase，TGase）在动物、植物和微生物的机体组织中广泛存在，能够催化肽链的谷氨酰胺残基中的γ-羧酰胺基和酰基受体发生转酰基反应，促使蛋白质或多肽之间发生共价交联[1]，改善蛋白质的溶解性、乳化性、弹性、稳定性和凝胶强度，实现不同质地和不同风味的蛋白食品生产[2]。根据来源不同分为两类，来源于动植物组织的称为组织谷氨酰胺转氨酶（tissue transglutaminase，TTGase），来源于微生物发酵制备的称为微生物谷氨酰胺转氨酶（microbial transglutaminase，MTGase）。MTGase不需要Ca2+的存在而起作用，分子质量多数在40 kDa左右，在pH 5～9范围内具有较好的稳定性和较高的酶活性，耐热的稳定性也较强[3]。MTGase属胞外酶，微生物发酵过程中可直接分泌到培养物中，酶的分离纯化较TTGase更容易。MTGase在食品工业、生物医药、化妆品、纺织工业等领域应用前景广阔，是各种新型蛋白质类制品生产和加工环节一种非常重要的酶制剂[4-5]。MTGase发酵生产具有原料来源广、成本低、周期短，可以不受环境条件制约进行规模化生产而受到广泛关注，成为生物酶制剂领域研究和开发的热点产品。近三十年来，国内外学者在MTGase产酶微生物、MTGase基因、产酶工程菌株构建与表达以及MTGase的分子改造技术等领域进行了大量研究工作，取得了不少进展。本文就MTGase的国内外研究现状及生物工程领域取得的研究进展进行了综述，对生物工程技术应用于MTGase的产品生产进行了展望，为高效和低成本MTGase的产品开发及应用提供新的思路和方法。

1 微生物谷氨酰胺转氨酶的国内外研究现状

为提高MTGase的产量和酶活，围绕着产酶微生物菌株的筛选和诱变技术进行了大量研究工作。MTGase最先在茂原链轮丝菌（Streptoverticillium mobaraensis）S-1182中分离得到，实现了产品规模化生产及商品化应用[3]。随后研究人员相继发现链轮丝菌属（Streptoverticillium）和链霉菌属（Streptomyces）的多个菌株都能分泌MTGase，如肉桂链轮丝菌（Streptoverticillium cinnamoneu）、拉达卡链轮丝菌（Streptoverticillium ladakanum）、吸水链霉菌（Streptomyceshygroscopicus）等[6]。DE BARROS L H等[7-8]研究发现，环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）也具备分泌MTGase功能。MTGase菌株商业化开发利用方面，除日本味之素的茂原链轮丝菌（Streptoverticillium mobaraensis）S-1182菌株外，还有荷兰微生物菌保中心的肉桂链霉菌（Streptomyces cinnamoneum）CBS683.68菌株、丹麦诺和诺德公司的利迪链霉菌（Streptomyces lydicus）NRRLB-3446菌株和扁平链霉菌（Streptomyces platensis）DSM40041菌株以及日本大阪发酵研究所的黎巴嫩链霉菌（Streptomyces libani）No.13452T菌株等[9-10]。

针对我国MTGase商品化应用一直没有取得生产性能良好且具有自主知识产权的优良菌株，造成产品生产成本高、价格昂贵、推广应用困难等技术难题，许多研究者一方面通过直接筛选高表达、高酶活的微生物菌株，另一方面通过微生物菌种诱变技术选育高效产酶菌株。祖海珍等[11]通过N-苄酯基-L-谷氨酰甘氨酸比色法从土壤中分离筛选一株产MTGase灰轮丝链轮丝菌（Streptoverticillium griseoverticillatum），酶活达到7 U/mL。段宇珩[12]对茂原链轮丝菌（Streptoverticillium mobaraensis）K21进行离子束诱变，筛选出产MTGase酶活达3.6 U/mL的S2菌株，菌株的产酶能力提高了56.52%。陈国娟等[13]以灰轮丝链轮丝菌（Streptoverticillium griseoverticillatum）ZC03为出发菌株，采用紫外线及氦（He）-氖（Ne）激光复合诱变技术，获得一株产MTGase性能稳定、酶活显著提高的ZC60菌株。夏书琴等[14]采用大气压辉光放电低温等离子体诱变技术对茂原链轮丝菌（Streptoverticillium mobaraensis）03-10进行诱变，选育出产MTGase突变菌株G2-1，酶活达2.73 U/mL，比原菌株提高82%。陈佳[15]采用紫外线和亚硝基胍（nitrosoguanidine，NTG）联合诱变技术结合96孔板筛选技术对茂原链轮丝菌（Streptoverticillium mobaraensis）进行诱变，选育出2株产MTGase生产性能分别提高45.4%和55.9%的诱变菌株。张莹等[16]利用紫外-硫酸二乙酯复合诱变技术处理茂原链霉菌（Streptoymyces mobaraensis），辅以高通量技术筛选MTGase高产菌株，结果表明经过诱变选育的菌株最高酶活达7.02 U/mL，比原菌株提高54%。郭玮婷等[17]利用NTG诱变技术结合96孔板高通量筛选方法从茂原链霉菌（Streptoymyces mobaraensis）中筛选到5株产MTGase耐热稳定性较高的突变菌株。田淑翠[18]对茂原链霉菌（Streptoymy-ces mobaraensis）HS47进行紫外线（ultraviolet，UV）、NTG和常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）诱变，筛选出一株产MTGase酶活为7.7 U/mL的高产菌株，酶活比原始菌株提高了3.08倍。蒋莹[19]利用常压室温等离子体（ARTP）诱变育种技术对茂原链霉菌（Streptoymyces mobaraensis）ECU7480进行多轮迭代诱变，选育的菌株发酵产MTGase酶活比原菌株提高了19%～27%，且经8次传代仍保持较高的产酶能力。张莹莹等[20]从土壤中分离细菌，经过酪蛋白凝胶反应初筛和Folk比色法测定酶活复筛，得到一株产MTGase的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）TGase1318，其所产MTGase耐高温性能较好。宋佳雯等[21]采用基因组重排技术，通过两轮基因组重排，辅以96孔板发酵高通量筛选和摇瓶发酵产酶试验，获得一株产MTGsae酶活达7.12 U/mL的茂原链霉菌（Streptoymyces mobaraensis）菌株，产MTGase酶活平均提高65.5%。叶坚[22]用ARTP和UV复合诱变技术对解朊金黄杆菌（Chryseobacterium proteolyticum）PF-Y0360进行诱变，获得菌株AU-J0789，产MTGase酶活较原菌株提高137%。

2 微生物谷氨酰胺转氨酶工程菌株的构建和表达

2.1 微生物谷氨酰胺转氨酶基因

到目前为止，MTGase的微生物编码基因共有数十种得到了分离和测序，以茂原链轮丝菌（Streptoverticillium mobaraensis）S-1182 的基因研究最为系统明确[3]，该基因全长1 249 bp，核苷酸的编码序列为+20～+1 237的1 218 bp核苷酸序列，共编码406个氨基酸残基，半胱氨酸活性位点处于氨基酸序列的64位，因此MTGase应归属于蛋白酶类。仪朝印等[23]以茂原链霉菌（Streptoymyces mobaraensis）基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）为模板，进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR），获得1条993 bp的基因片段，从第46个碱基开始对ATG编码氨基酸，编码由316个氨基酸组成的蛋白质。刘松等[24]通过PCR扩增反应得到吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）WSH03-13TGase基因，该基因开放阅读框共编码418 个氨基酸（aa），由信号肽（29 aa）、酶原区（57 aa）及TGase（332 aa）组成。在TGase开放阅读框上游约500 bp有一个启动子序列，在TGase开放阅读框下游12 bp处有一个TGase基因转录的终止子。张宇[25]研究发现，吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）St4MTG基因编码长为1 251 bp，第149位氨基酸Cys为活性中心位点，成熟MTGase分子中催化三联体为Cys149-His359-Asp346。DURAN R等[26]分离了肉桂链轮丝菌（Streptoverticillium cinnamoneum）CBS683.68的MTGase基因，蛋白质前体由一条81个氨基酸残基组成的信号肽和一个330个氨基酸残基组成的成熟MTGase。王玉等[27]克隆了来自于拉达克轮丝菌（Streptoverticillium ladakanum）B1的MTGase基因，经PCR扩增反应得到MTGase的前导肽（pro）和除前导肽以外成熟的MTGase基因，长度在1 200～2 000 bp。

芽孢杆菌属（Bacillus）MTGase基因的发现，使得开发不同种类和不同特性的MTGase成为可能。KOBAYASHI K等[28]最早在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中研究发现和克隆了MTGase的基因，但发现MTGase的基因没有信号肽。张莹莹等[20]用PCR方法克隆了枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）TGase1318编码基因tgl，序列长738 bp，编码由245个氨基酸组成。余小娜[29]从产酶菌株MEPE0134中获得MTGase基因，用PCR方法扩增出基因tgl序列长750 bp，测序分析表明该基因与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的相似性最高。

2.2 微生物谷氨酰胺转氨酶工程菌株的构建和表达

由于天然微生物菌株产MTGase能力不强，虽经筛选和诱变技术处理在一定程度上可以提高菌株产酶能力，但很难达到商品化生产的要求，构建基因工程菌株是提高MTGase酶活和产量的有效途径。日本味之素公司、德国Martin-Luther 大学、台湾食品工业发展研究所、中国科学院微生物研究所、江南大学、华东师范大学、华东理工大学以及诺和诺德（中国）制药有限公司等先后开展了MTGase工程菌株构建及表达方面的研究。表达研究涉及MTGase成熟酶和酶原（pro-TGase）的表达以及选择适宜的宿主、共表达融合酶蛋白、共表达酶原区等。大多数链霉菌类和部分芽孢杆菌类MTGase基因已在大肠杆菌、酵母菌、链霉菌、芽孢杆菌及棒杆菌等宿主中实现成功表达[24]。

2.2.1 微生物谷氨酰胺转氨酶工程菌株的构建和表达

WASHIZU K等[30]将茂原链轮丝菌（Streptoverticillium mobaraensis）S-8112的MTG产酶基因导入变铅青链霉菌（Streptomyces lividans）中取得成功表达。KIKUCHI Y等[31]将来源于茂原链轮丝菌（Streptoverticillium mobaraense）SAMP45基因转入谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）的细胞内进行表达，该基因还可以对MTGase前体酶原蛋白进行定点改造，最终得到活性较高的MTGase。MARX C K等[32]将来源于茂原链霉菌（Streptoymyces mobaraensis）的MTGase酶原（pro-MTG）蛋白在大肠杆菌（Escherichia coli）中进行表达，经乳糖和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG）低温诱导，表达量分别达到65 mg/L和4.5 mg/L，酶活分别达到627 U/g和447 U/g，乳糖诱导的表达量和酶活显著优于IPTG诱导。NODA S等[33]将肉桂链轮丝菌（Streptoverticillium cinnamoneum）的MTGase基因转入变铅青链霉菌（Streptomyces lividans）中并成功实现了表达，以木糖作为唯一碳源进行发酵，重组工程菌的MTGase产量达到530 g/L。ITAYA H等[34]将来源于茂原链霉菌（Streptoymyces mobaraensis）的MTGase酶原基因在不同的棒杆菌中进行重组，发现多数种类的棒杆菌都能高效表达MTGase。YURIMOTO H等[35]将茂原链霉菌（Streptoymyces mobaraensis）的MTGase酶原基因在甲醇酵母中得到成功表达，同时还在变铅青链霉菌（Streptomyce lividans）、大肠杆菌（Escherichia coli）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）等宿主中进行表达[36]。

任增亮等[37]在吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）培养液中分离纯化得到MTGase的酶原（pro-MTGase），克隆该酶原基因并将其转入表达载体pET-20b（+）信号肽pelB的下游，获得重组表达载体pET/pro-MTG。重组表达载体分别在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）和Rosetta（DE3）pLysS中进行表达，低温条件下诱导，获得胞外可溶性表达的MTGase酶原，用胰蛋白酶切除酶原前导区域，获得有活性的MTGase，最高酶活达到0.24 U/mL。刘松等[24]将吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）WSH03-13的TGase基因在变铅青链霉菌（Streptomyces lividans）TK24进行表达，发酵罐发酵MTGase酶活达到3.2 U/mL，在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中表达，MTGase酶活达到6.8 U/mL。舒畅[38]将茂原链霉菌（Streptoymyces mobaraensis）来源的MTGase基因及相关突变基因在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达，经过诱导表达、激活酶原、镍（Ni）柱纯化等工艺处理，得到6种重组MTGase，最高表达酶活达到54.62 U/mL。仪朝印等[23]以茂原链霉菌（Streptoymyces mobaraensis）的DNA构建重组质粒pET-22b-MTG，将重组质粒在大肠杆菌（Escherichia coli）中进行表达，MTGase最高酶活达到15.9 U/mL。唐名山[39]从茂原链轮丝菌（Streptoverticillium mobaraensis）WSH-22中克隆出MTGase基因，在表达载体pQE-30T中构建重组质粒pMTG，将重组质粒pMTG转化至大肠杆菌（Escherichia coli）M15中，在IPTG诱导下成功表达MTGase，最高表达酶活达到21.3 U/mg。张宇[25]将吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）的MTGase基因与大肠杆菌（Escherichia coli）细胞内表达载体pET-23（a）和pET-32（a）连接，构建重组质粒pET-23（a）-MTGase和pET-32（a）-MTGase，转入大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中进行表达，MTGase酶活表达达到10.23 U/mL。张莹莹等[20]用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）表达载体pTZ，用大肠杆菌（Escherichia coli）表达载体pET21b，分别构建含基因tgl的重组质粒，转化为工程菌枯草芽孢杆菌WB800和大肠杆菌（Escherichia coli）BL21，结果表明基因tgl在大肠杆菌中表达MTGase的效果比枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）更好。陆姣姣[40]将茂原链霉菌（Streptoymyces mobaraensis）的基因分别在枯草芽孢杆菌和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）中构建组成型和诱导型MTGase表达载体，并对表达时间、诱导时间和诱导剂浓度等因子进行优化，取得表达MTGase的枯草芽孢杆菌和乳酸乳球菌的工程菌株，表达的MTGase采用激活酶原和Ni柱纯化等处理工艺，得到活性更高的MTGase。研究同时表明，激活酶原后的MTGase催化大豆分离蛋白的能力更强。

2.2.2 微生物谷氨酰胺转氨酶融合蛋白为载体的工程菌构建和表达

YU Y J等[41]从链霉菌（Streptomyces netropsis）BCRC 12429中克隆到MTGase（Sn TGase）基因，在大肠杆菌中共表达Sn TGase N 端的前导序列和硫氧还蛋白，重组后MTGase融合蛋白（Trx-proTGase）的表达量为180 mg/L，牛胰蛋白酶处理，MTGase的酶活达到24.9 U/mg。黄柯等[42]从茂原链霉菌（Streptoymyces mobaraensis）中克隆MTGase基因，构建重组表达载体pGEX-TGase，转至大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中，构建重组大肠杆菌（Escherichia coli）BL21/pGEX-TGase，重组菌在IPTG诱导条件下产生GST-TGase融合蛋白，实现MTGase融合蛋白的高效表达。邵坤彦等[43]以吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）的DNA为模板，采用PCR扩增的方法得到MTGase基因，构建重组质粒pGEXTGase并转至大肠杆菌（Escherichia coli）中获得BL21/pGEXTGase重组菌，重组菌通过乳糖诱导产生融合蛋白，采取稀释及尿素梯度液相色谱相结合的方法处理融合蛋白，实现包涵体融合蛋白复性，经纯化处理得到酶活为29 U/mg的MTGase。周建等[44]从枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）DB403染色体中克隆出MTGase基因，以融合蛋白的形式在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达硫氧还蛋白-MTG融合蛋白，同时发现该融合蛋白也具有MTGase的活性，表明产品在生产过程中可直接添加该融合蛋白，降低MTGase的生产和应用成本。刘凯等[45]以枯草芽孢杆菌DNA扩增获得带有SD序列及谷氨酸棒杆菌信号肽ΔS0949的BTG基因，将其与大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体pXMJ19连接，构建重组质粒pXMJ19-Sbtg转至谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032，经IPTG诱导该重组菌可以表达MTGase。

3 微生物谷氨酰胺转氨酶的分子改造技术

MTGase分子改造主要通过定点突变和随机突变对MTGase分子结构进行改变。定点突变改变的目标是MTGase活性中心Cys64附近的氨基酸残基，随机突变改变的目标是整个MTGase分子结构。目前获得MTGase高酶活的突变菌株主要是通过对MTGase分子活性中心Cys64附近的氨基酸残基和其N末端的氨基酸残基进行生物学改造来实现[46-47]。CHEN K 等[48]通过删除MTGase分子N末端前4个Asp、Ala、Ala、Asp的氨基酸残基，促使MTGase的酶活提高32.92%。LIU S等[49]采用TGase或pelB信号肽实现了吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）来源的MTGase在大肠杆菌（Escherichia coli）中以酶原的形式进行表达，将酶原N端切掉，形成具有酶的活性MTGase。SHIMBA N等[50]研究表明，MTGase分子N末端的氨基酸残基适度缺失或被取代，可提高MTGase的催化活性。ZOTZEL J等[51]在研究MTGase产生过程时发现，链霉菌属（Streptoymyces）来源的MTGase，在机体细胞内先以酶原（pro-TGase）的形式合成，分泌到胞外通过金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶切除N-端酶原区后折叠成为具有活性的MTGase。王坤等[52]通过对茂原链霉菌（Streptoymyces mobaraensis）MTGase酶原的基因序列密码子进行改造优化，降低基因中鸟嘌呤（Guanine）和胞嘧啶（Cytosine）的含量，提高其在大肠杆菌（Escherichia coli）中的表达水平，结果MTGase酶原的表达量提高了4.4倍。同时利用融合PCR的定点突变技术将MTGase第二位的丝氨酸改造为脯氨酸，改造后MTGase的酶活提高了1.26倍。任蕊蕊等[53]借助于Discovery Studio 2017软件分析，确定了茂原链霉菌（Streptoymyces mobaraensis）的MTGase与底物α-N-CBZ-GLN-GLY亲和力氨基酸位点，通过定点突变处理获得酶活和催化能力都提高的E300W突变体，突变体表达的MTGase酶活提高31%。

4 微生物谷氨酰胺转氨酶的生产及应用展望

MTGase具有优良的交联作用，有助于提高蛋白质的水溶性、起泡性、乳化性和热稳定性，改善蛋白质产品的外观、质构和风味，应用前景十分广阔。产品开发利用方面，酶活的高低对MTGase的应用有重要影响，高效表达酶活的MTGase生产菌株成为目前研究的重点。研究表明，MTGase高产工业化应用菌株可以通过筛选新的MTGase微生物高产菌株、对现有的微生物菌株进行诱变提高其产酶性能、构建MTGase工程菌株和对MTGase 进行分子改造再构建MTGase工程菌株等途径获得。构建工程菌株是提高MTGase产量和酶活的有效手段，通过生物工程技术获得的MTGase菌株产酶性能不易发生衰退，酶活表达水平会更高，可以突破MTGase在天然微生物产酶菌株中酶活表达水平低，造成MTGase生产和应用成本过高的技术难题。因此利用生物工程技术最有希望获得拥有自主知识产权的MTGase工业化生产应用菌株，满足食品、生物医学、化妆品、纺织等领域不断开发蛋白质类新产品应用需求，促进行业健康快速发展。