响应面法优化欧李果汁与牛奶复合益生菌饮料发酵工艺

陈佳佶，成婧荷，崔清宇，郭嫦娥，王占军，李卫东*

（1.北京中医药大学 中药学院，北京 102488；2.中药材规范化生产教育部工程研究中心，北京 102488；3.宁夏农林科学院 荒漠化治理研究所，宁夏 银川 750002）

益生菌是生长于人体肠道及生殖系统内，有助于维持人体健康以及改善人体微生态平衡的一类微生物[1]。近年来，益生菌对人类健康的作用受到日益关注，有关其生理活性以及营养功能的深入探究也被研究者们提上了日程。研究表明，益生菌对人类健康的作用主要包括缓解腹泻与乳糖不耐症、维持肠道菌群平衡、增强免疫力和降血脂等[2-5]。

水果作为一种重要的膳食，被认为是益生菌的理想载体，其不仅含有益生菌生长的必需营养素，且极具风味[6]。目前广泛用于水果发酵的益生菌主要包括植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acido-philus）、双歧杆菌（Bifidobacterium）、保加利亚乳杆菌（Lacto bacillus bulgaricus）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）等[7]。高玉荣等[8]用嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）作为发酵菌株，通过单因素和正交试验对葡萄汁发酵工艺进行了优化，发现初始pH值、接种量、发酵温度和发酵时间对活菌数和感官评分影响显著。郗恩光等[9]利用响应面法对香蕉金针菇饮料的发酵工艺进行了优化，结果表明香蕉∶金针菇汁为4∶1（V/V），发酵剂接种量为4%，蔗糖添加量为5.5%时，感官评分和乳酸含量较高。刘秋豆等[10]对用保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）和嗜热链球菌（Lactobacillus acidophilus）发酵的芒果益生菌饮料进行成分检测，发现蛋白质、总糖、维生素C、水分、可溶性膳食纤维和总酚含量增加，还原糖含量显著减少，说明发酵果汁的营养价值更高。另外，研究者对其他的一些果蔬原料也进行了益生菌发酵研究，如火龙果皮[11]、梨[12]和红树莓[13]等。

欧李（Cerasus humilis（Bge.）Sok.）为蔷薇科（Rosaceae）樱属（Cerasus）多年生小灌木[14]。欧李植株根系强大，根冠比为9∶1，具有抗寒、耐旱、耐贫瘠、适应性强等特性，是改良土壤、治理荒漠化及防止水土流失的珍稀树种[15-16]。其核果成熟后近球形，颜色鲜艳丰富，气味清香宜人[17-18]，富含多种维生素、矿物质、氨基酸和多酚，其中钙含量居水果榜首，又被誉为“钙果”，具有非常高的综合开发价值[19-22]。但欧李糖酸比较高，不耐储藏和运输，成为了欧李产业发展的瓶颈。目前欧李开发的产品主要有果脯、果酱、冻干果、果汁、果酒等，关于欧李复合益生菌饮料工艺尚鲜见报道。本研究以欧李和牛奶为主要原料，采用植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）及青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）等益生菌进行发酵，制备复合益生菌饮料，并通过单因素试验考察和响应面试验设计对其发酵工艺进行优化，旨在为欧李的综合开发利用提供新途径，也为国内益生菌饮料提供新产品。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料和菌株

京欧2号欧李：采集于内蒙古自治区正蓝旗（五一牧场二分厂，北纬N42°21′53.77″东经E116°11′57.93″）。欧李近成熟期（水果硬度大于85%）采收后迅速冷链转运到实验室，经水洗和去杂质后，分装，-80 ℃低温保存备用；脱脂奶粉：内蒙古伊利实业集团股份有限公司；白砂糖（食品级）：南京甘汁园糖业有限公司。

植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum，LP）BNCC 185342、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus，LA）BNCC 185342、青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis，BA）：北纳创联生物技术有限公司。

1.1.2 试剂

果胶酶（40 U/mg）：北京酷来博科技有限公司；酵母提取物：广东一品鲜生物科技有限公司；总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.1.3 培养基

MRS培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.2 仪器与设备

JE2600家用榨汁机：北京中兴柏翠电器有限公司；BAS 124S电子天平：德国赛多利斯股份公司；HH-S4A电热恒温水浴锅：北京科伟永兴仪器有限公司；BY-G20型高速离心机：北京白洋医疗器械有限公司；LH-T32手持折光仪：杭州陆恒生物科技有限公司；UV2800紫外-可见分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 欧李果汁与牛奶复合益生菌饮料加工工艺流程

欧李果实→分选清洗→破碎去核→打浆→酶解过滤→欧李果汁→添加脱脂牛奶→调整糖度→灭菌→接种→发酵→成品

1.3.2 操作要点

欧李果汁制备：选取成熟度一致、无损伤、无病虫害的欧李果实洗净，去核，用榨汁机破碎得到45%的欧李果浆，按照30 mg/kg添加果胶酶[25]，于35 ℃水浴下酶解5 h，用四层纱布过滤得欧李果汁。

添加脱脂牛奶和白砂糖：在上述欧李果汁中添加12%的脱脂牛奶（固形物含量10%），调整糖度后倒入发酵容器中。

菌种活化：将-80 ℃冷冻保藏的植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、青春双歧杆菌甘油管解冻至室温，在超净工作台分别将100 μL、300 μL、300 μL菌种接种至MRS固体培养基中，37 ℃下培养箱中培养48 h。

种子液制备：配制基质，基质配方为酵母提取物10 g，白砂糖20 g，蒸馏水1000 mL，搅拌均匀后，置于高速离心机中，转速4 000 r/min离心5 min获取上清液，115 ℃高压灭菌15 min，冷却至室温，备用。挑取上述活化的植物乳杆菌接种于灭菌后的基质中，置于37 ℃培养箱中培养8 h；分别挑取上述活化的嗜酸乳杆菌和青春双歧杆菌于灭菌后的基质中，置于37 ℃培养箱中培养24 h。

灭菌：将调配好的欧李果汁与牛奶于90 ℃水浴下灭菌8 min。

接种：冷却至室温后在超净工作台中接种5%种子液。

发酵：于37 ℃培养箱中进行发酵一定时间，即得欧李果汁与牛奶复合益生菌饮料。

1.3.3 欧李果汁与牛奶复合益生菌饮料发酵工艺优化

（1）单因素试验

选取菌株（LA∶BA=1∶1、LP∶BA=1∶1、LP∶LA=1∶1、LP∶LA∶BA=1∶1∶1，V/V）、欧李果汁添加量（35%、40%、45%、50%、55%、60%）、脱脂牛奶添加量（0、4%、8%、12%、16%、20%）、糖度（10°Bx、11°Bx、12°Bx、13°Bx、14°Bx、15°Bx）、接种量（3%、4%、5%、6%、7%、8%）和发酵时间（24 h、32 h、40 h、48 h、56 h、64 h）进行单因素考察，以探讨其对总抗氧能力（T-AOC）和乳酸菌活菌数的影响。

（2）响应面试验设计

在单因素试验设计基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，以总抗氧化能力（Y1）和活菌数（Y2）为响应值，选取欧李果汁添加量（A）、脱脂牛奶添加量（B）、接种量（C）和发酵时间（D）为自变量，采用4因素3水平响应面试验设计，以确定欧李果汁与牛奶复合益生菌饮料最佳发酵工艺。

表1 Box-Behnken试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.4 检测方法

总抗氧化能力（T-AOC）测定：采用总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒；活菌数测定：按照GB 4789.35—2016《食品微生物学检验乳酸菌检验》[23]。

2 结果与分析

2.1 发酵工艺优化单因素试验

2.1.1 不同发酵菌株对饮料总抗氧化能力和活菌数的影响

图1 不同发酵菌株对饮料总抗氧化能力和活菌数的影响Fig.1 Effect of different fermentation strains on total antioxidant capacity and viable cell number of beverage

由图1可知，接种菌株为LA∶BA（1∶1）时，饮料的总抗氧化能力和活菌数达到峰值，分别为127.81 U/mL和8.14 lg（CFU/mL），这可能和LA生长速度较快有关。综合考虑，选择最佳发酵菌株及配比为LA∶BA=1∶1。

2.1.2 欧李果汁添加量对饮料总抗氧化能力和活菌数的影响

图2 欧李果汁添加量对饮料总抗氧化能力和活菌数的影响Fig.2 Effect of Cerasus humilis juice addition on total antioxidant capacity and viable cell number of beverage

由图2可知，随欧李果汁添加量的增加，饮料总抗氧化能力和活菌数呈现先上升后下降的趋势。欧李果汁添加量在35%～50%范围时，总抗氧化能力和活菌数逐渐上升，在欧李果汁添加量为50%时，达到峰值，分别为127.81 U/mL和8.20 lg（CFU/mL），继续增加欧李果汁添加量，总抗氧化能力和活菌数均下降。欧李果汁添加量比较低时，饮料中营养成分和多酚含量较少，影响了乳酸菌的生长。欧李果汁添加量过高时，饮料pH降低，不利于乳酸菌生长。综合考虑，选择最佳欧李果汁添加量为50%。

2.1.3 脱脂牛奶添加量对饮料总抗氧化能力和活菌数的影响

图3 脱脂牛奶添加量对饮料总抗氧化能力和活菌数的影响Fig.3 Effect of skimmed milk addition on total antioxidant capacity and viable cell number of beverage

由图3可知，当脱脂牛奶添加量＜16%时，随着脱脂牛奶添加量的增加，两个指标随之增加，在脱脂牛奶添加量为16%时达到峰值，分别为127.54 U/mL和8.32 lg（CFU/mL）。当脱脂牛奶添加量＞16%之后，总抗氧化能力和活菌数下降。脱脂牛奶可为乳酸菌的生长提供氮源，促进乳酸菌的生长，但当脱脂牛奶添加量增加到一定程度时，脱脂牛奶中的蛋白质会与多酚结合形成沉淀，影响饮料的总抗氧化能力[24]。综合考虑，选择最佳脱脂牛奶添加量为16%。

2.1.4 糖度对饮料总抗氧化能力和活菌数的影响

图4 糖度对饮料总抗氧化能力和活菌数的影响Fig.4 Effect of sugar content on total antioxidant capacity and viable cell number of beverage

由图4可知，随着糖度的增加，饮料总抗氧化能力和活菌数变化较小，说明糖度对饮料发酵影响较小，这可能是由于欧李果汁本身含糖量较高，能够满足乳酸菌的生长需求。综合考虑成本和口感，选择最佳糖度为12°Bx。

2.1.5 接种量对饮料总抗氧化能力和活菌数的影响

图5 接种量对饮料总抗氧化能力和活菌数的影响Fig.5 Effect of inoculum on total antioxidant capacity and viable cell number of beverage

由图5可知，接种量在3%～7%范围内时，两个指标随着接种量的增加而随之增加，在接种量为7%时达到峰值，分别为133.53 U/mL和8.38 lg（CFU/mL）。当接种量＞7%时，总抗氧化能力和活菌数下降，这可能是由于增加接种量会导致其代谢产物浓度的增加，不利于菌种的继续生长。综合考虑，选择最佳接种量为7%。

2.1.6 发酵时间对饮料总抗氧化能力和活菌数的影响

图6 发酵时间对饮料总抗氧化能力和活菌数的影响Fig.6 Effect of fermentation time on total antioxidant capacity and viable cell number of beverage

由图6可知，总抗氧化能力和活菌数趋势一致，随着发酵时间的延长先上升后下降，活菌数在40 h达到峰值，为8.39 lg（CFU/mL），总抗氧化能力在48 h达到峰值，为126.99 U/mL。发酵时间过长，会导致菌种老化自溶，使饮料总抗氧化能力和活菌数下降。综合考虑，选择最佳发酵时间为48 h。

2.2 发酵工艺优化响应面试验

2.2.1 响应面试验设计与结果

根据单因素试验结果，选择欧李果汁添加量（A）、脱脂牛奶添加量（B）、接种量（C）和发酵时间（D）进行4因素3水平的Box-Behnken试验设计，共计29次试验，结果见表2，方差分析见表3。

表2 Box-Behnken试验设计与结果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

利用Design-Expert 8.0.6分析软件对试验结果进行多元回归分析，得到总抗氧化能力（Y1）和活菌数（Y2）的预测模型：

Y1=131.16-6.43A-5.92B-0.78C+2.18D-0.92AB-1.94AC-1.74AD+2.45BC+3.16BD+2.04CD-13.19A2-3.55B2+0.59C22+2.78D2

Y2=8.41+0.017A-0.098B-0.096C-0.052D-0.008 691AB+0.13AC+0.12AD+0.08BC-0.061BD+0.024CD-0.20A2+0.051B2-0.000 299 1C2-0.03D2

由表3可知，模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），模型决定系数R2=0.940 3，说明回归方程有较高拟合度和相关性，模型预测值能较好地反映实际值[25]，可以对欧李与牛奶复合益生菌饮料发酵总抗氧化能力进行分析和预测。一次项A、B、二次项A2对结果影响达到极显著水平（P＜0.01），一次项D、二次项B2对结果影响达到显著水平（P＜0.05）。各因素对总抗氧化能力的影响顺序分别是：欧李果汁添加量＞脱脂牛奶添加量＞发酵时间＞接种量。

表3 以总抗氧化能力为评价指标的响应面试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface tests results using total antioxidant capacity as evaluation indicator

由表4可知，模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），模型决定系数R2=0.896 2，说明回归方程有较高拟合度和相关性，模型预测值能较好地反映实际值，可以对欧李与牛奶复合益生菌饮料发酵活菌数进行分析和预测。一次项B、C、交互项AC、AD、二次项A2对结果影响达到极显著水平（P＜0.01），一次项D对结果影响达到显著水平（P＜0.05）。各因素对总抗氧化能力的影响顺序分别是：脱脂牛奶添加量＞接种量＞发酵时间＞欧李果汁添加量。

表4 以活菌数为评价指标的响应面试验结果方差分析Table 4 Variance analysis of response surface tests results using viable cell number as evaluation indicator

2.2.2 各因素交互作用分析

图7 各因素交互作用对活菌数影响的响应面及等高线Fig.7 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between each factors on viable cell number

各因素对总抗氧化能力的交互作用不显著。由图7可知，欧李果汁添加量和接种量，欧李果汁添加量和发酵时间对活菌数交互作用响应面曲面较陡，即欧李果汁添加量和接种量，欧李果汁添加量和发酵时间交互作用显著。其余各因素对活菌数交互作用不显著，这与方差分析结果一致。

2.2.3 验证试验

以总抗氧化能力和活菌数为响应指标，拟合出的最佳发酵工艺为欧李果汁添加量48.93%，脱脂牛奶添加量12.25%，接种量6.10%，发酵时间40.65 h，此条件下总抗氧化能力理论值为141.48 U/mL，活菌数理论值为8.72 lg（CFU/mL）。为了便于实际操作，修正工艺参数为欧李果汁添加量49%，脱脂牛奶添加量12.3%，接种量6%，发酵时间41 h。接种菌种植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌，糖度12°Bx，在此优化条件下重复发酵3次，得到总抗氧化能力实际值为143.33 U/mL，与理论值相对误差为1.31%，活菌数实际值为8.70 lg（CFU/mL），与理论值相对误差为0.23%，与理论值基本一致，可为实际发酵提供依据。

3 结论

本试验以欧李果汁和牛奶为主要原料制作欧李复合益生菌饮料，以总抗氧化能力和活菌数为评价指标，针对发酵菌种、欧李果汁添加量、脱脂牛奶添加量、糖度、接种量和发酵时间进行单因素考察，并在此基础上对欧李果汁添加量、脱脂牛奶添加量、接种量和发酵时间进行响应面试验优化，得到欧李益生菌饮料最佳发酵工艺为发酵菌株植物乳杆菌∶嗜酸乳杆菌（1∶1），欧李果汁添加量49%，脱脂牛奶添加量12.3%，糖度12°Bx，接种量6%，发酵时间41 h。得到的饮料色泽鲜艳，口感适宜，总抗氧化能力为143.33 U/mL，活菌数为8.70 lg（CFU/mL）。利用乳酸菌进行发酵，可以改善欧李风味，为欧李的综合开发利用提供新途径。