合成微生物群落及在发酵食品中应用研究进展

张小龙，王嘉瑞，李青卓，付彩霞，汪 超，徐 宁*

（1.湖北工业大学生物工程与食品学院湖北省食品发酵工程技术研究中心，湖北武汉 430068；2.湖北土老憨生态农业科技股份有限公司，湖北宜昌 443000）

微生物作为地球上蕴含量巨大且最具发展潜力的生物资源，近年来随着基因测序技术的发展和成本的降低，人们对微生物的分析在不断增加。在早期的生物学研究中，研究者的目光主要集中在微生物单群体，其作为微生物群落中的关键功能群体将其分离、改造，以实现目标功能的加强[1]。然而人们忽视了微生物并不是单独存在的，而是处于复杂的、动态的群落中，正是它们的相互作用推动了群落的稳定、功能与进化[2]。近年来，随着食品发酵技术应用需求的不断提高，由于功能单一的菌种在提高风味品质方面存在着局限性，使得利用多种功能微生物组合来构建合成微生物群落成了发酵食品领域中一个研究的热点。所谓的合成微生物群落是指在明确培养基质的条件下，人工将两种或两种以上遗传背景完全解析的微生物通过共同培养而形成的微生物群体，其组成可以是自然界中不一定共存的野生型菌株也可以是一个或多个经基因改造的工程菌株[3-4]。合成微生物群落实现了从传统单一菌种行为研究向整个微生物群落行为研究的转变。

合成微生物群落涉及的研究领域众多，其最终目标是利用单个微生物的个体能力以及微生物间的相互作用，对复杂的代谢任务进行劳动分工、功能互补，从而实现特定的功能，如提高种群的生产力、稳定性、代谢功能等[5]。由于合成微生物群落中的微生物是可控性的，因此可以按功能导向性的需求对微生物进行组装，使微生物彼此配合发挥更大的作用。而中国传统的食品酿造是一个典型多菌种参与的复杂过程，因此若能够构建出稳定高效的发酵微生物群落将对提高发酵食品质量有着重要的意义。该文将对合成微生物群落的特征、微生物间的相互作用和调控机制以及其近年来在发酵食品领域的应用进行概述，并对如何构建稳定、高效的发酵微生物群落进行了展望，旨在为合成微生物群落在发酵食品行业的进一步深入研究及开发应用提供参考。

1 合成微生物群落的特征

与单菌种或自然群落相比，合成微生物群落具有以下特征：①相较于单菌种，微生物群落具有更广泛的代谢灵活性，通过物种间交流能够更有效地催化许多复杂过程，执行对单个菌株来说很难甚至是不可能完成的复杂任务[6-7]；②与自然微生物群落相比，合成微生物群落往往更倾向于生态理论的研究，因为合成的微生物群落中的物种是已知的，具有明确的遗传特性，且复杂性较低、可控性较强[4，8]；③与单菌种相比，群落中微生物物种丰富，可以将复杂的代谢途径进行划分，通过成员间的劳动分工和资源交换可以降低细胞的代谢负担[9-10]；④由于遗传存在着不稳定性，对于单菌种来说生长环境的改变会对其产生干扰，使其产生不需要的副产物，而微生物群落中混合物种代谢模式多样，且菌种间存在沟通和交流，使其比单一菌种具有更高的稳定性，对待外界环境的扰动具有更高的抵抗性[11-12]；⑤合成微生物群落与自然微生物群落相比物种较少，且结构简单，可以从分子系统理论出发，通过网络推理和元组数据的动态建模进行描述，并且由此可以用来开发和验证更复杂的、系统的模型[13-14]。

2 合成微生物群落相互作用和调控机制研究

在自然界中，群落的的稳定性通常是通过群落中微生物间的相互作用来调节，因此构建微生物群落必须要考虑微生物间可能存在的相互作用形式，物种间相互作用形式一般分为：通过交叉喂养的方式进行代谢相互作用，通过代谢物和自诱导信号分子的传递进行种间相互作用，以及在环境的刺激下进行种间相互作用，因此可以通过改变细胞交流、物种代谢作用、生长环境等方式对微生物间的相互作用进行调控，从而对合成微生物群落进行改造，实现特定的功能。

2.1 微生物间的相互作用研究

自然界中大多数微生物并不是作为一个独立的个体单独存在的，而是作为一个复杂的、高度多样化和高度动态化的微生物群落中的一部分而存在的，在群落中成员之间存在着相互交流和合作，通过成员间的相互作用来影响着群落的行为表现，进而影响着群落的应用[2]。群落中物种间的相互作用机制一直是生态学研究者热点研究的领域，因为物种间不同类型的相互作用不仅是影响微生物群落结构和功能的主要因素之一，同时也被认为是影响生物多样性产生的关键因素之一[15]。在自然群落中，微生物与其他系统发育类群的微生物不断相互作用，从而形成复杂的生态相互作用网络，经研究物种间的相互作用可以分为积极的和消极的两种类型，积极的相互作用包括共生（互利共生和偏利共生），消极的相互作用包括寄生、捕食以及竞争[16]。由于菌种间存在复杂的交互关系，因此在构建微生物群落时要考虑参与菌种的功能、分布和生长环境等众多因素，而不是将多种微生物进行的随机组合。

2.2 基于代谢作用对微生物间相互作用调控

在合成微生物群落中的微生物之间可以通过交换代谢物进行交流，利用资源的共享实现微生物间的相互作用[17]。研究发现在利用蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）和泡囊短波单胞菌（Brevundimonas naejangsanensis）混菌发酵生产氢的过程中存在基于代谢物交换介导的相互作用。在发酵过程中蜡样芽孢杆菌通过代谢作用能够将淀粉转化为乳酸，其作为碳源和电子供体，为泡囊短波单胞菌的细胞生长和产氢提供支持；作为回报，泡囊短波单胞菌通过代谢产生甲酸盐，作为电子载体穿梭到蜡样芽孢杆菌并供其利用，促进了氢的产生。结果发现混合菌株分别与两株单菌种发酵相比，淀粉的利用率提高了14.7%和27.5%，氢的产量提高了42.3%和58.2%，从而有效的克服了单一菌株在代谢工程中存在的局限性[18]。此外，群落中的微生物还可以通过交换代谢中间物来影响彼此的活动，这些代谢中间物可以促进或抑制对方的生长，实现物种间的相互作用，进而协调整个群落的活动[19]。

2.3 基于细胞交流对微生物间相互作用调控

在微生物群落中，一些微生物之间存在的细胞交流是基于分泌特定的分子产生的，使得微生物之间存在着许多以不同小分子为依赖的相互作用[20]。目前研究最为普遍的细胞交流方式是基于群感效应的专有信号分子的传导，这些信号分子包括细胞产生的胞外酶、次级代谢物等，同时微生物还可以利用与新陈代谢和生长有关的化学物质来建立细胞间的相互作用[21]。细菌能够释放信号小分子，当信号小分子在周围介质中积累并达到一定浓度时可以与其他细菌进行交流，通过群落变化来感知邻近物种的存在，测量它们的细胞密度，调节它们的基因表达，协调它们的团体行为，从而实现了特定的功能[8，22]。研究发现铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）与白色念珠菌（Candida albicans）之间存在着的相互作用是理解真菌和细菌如何通过群体感应系统相互调节的重要模型。通过将铜绿假单胞菌和白色念珠菌共培养时，铜绿假单胞菌可以合成2-庚基-3-羟基-4-喹诺酮和3-氧-十二烷-高丝氨酸-内酯等小分子，从而构成复杂的群体感应系统，在该系统中，铜绿假单胞菌可以附着在丝状形式的白色念珠菌上，并合成许多包括苯亚胺、绿脓杆菌、溶血性磷脂酶等小分子，从而有效的抑制白色念珠菌产生有毒物质，减少对人体的伤害[23]。

2.4 基于环境因素对微生物间相互作用调控

在微生物群落中，微生物的生长环境不仅影响着微生物的生长繁殖，同时还影响群落的物种组成，进而影响着微生物间的相互作用。因此在构建微生物群落时可以通过改变物种的生存环境，如改变群落环境中的温度、湿度、氧气水平、培养基中营养物质的可利用性以及环境中有毒化合物的存在与否等因素，来协调群落的物种组成，促进物种间的相互作用，从而对合成微生物群落进行改造，实现特定的功能[24-25]。研究发现在利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和旧金山乳杆菌（Lactobacillus sanfranciscensis）混菌发酵面团时可以通过控制氧气的供应来促进酿酒酵母与旧金山乳杆菌之间的相互作用。在发酵过程中酿酒酵母可以通过代谢作用将糖类转化为CO2，体系中大量CO2的生成为厌氧型乳酸菌旧金山乳杆菌提供呼吸保护，使其免受氧的抑制，从而有效的促进了旧金山乳杆菌细胞的生长；同时旧金山乳杆菌通过代谢作用可将麦芽糖和蛋白质水解为葡萄糖和氨基酸等物质，以供酿酒酵母利用，混菌相互作用改变了面团发酵体系中微生物的生长环境，促进了二者的生长，使面团的发酵时间对比单菌株缩短，面团中氨基酸含量提高，这对面团品质的提高有着重要的意义[26-27]。

3 合成微生物群落的应用

近年来，随着科技的不断发展和对单菌种研究的不断增加，通过将理论与技术相结合，构建出稳定高效的微生物群落，使得合成微生物群落应用不断扩展，其中包括发酵食品领域主要涉及酱油、白酒、食醋、酸奶等的生产应用。

3.1 酱油生产应用

微生物在酱油酿造的过程中发挥着关键作用，我国酱油生产多采用单一的米曲霉（Aspergillus oryzae）纯种制曲，利用米曲霉制曲时分泌的各种酶来分解原料中的蛋白质、淀粉等营养物质并进一步发酵而成[28]。单一米曲霉制曲时对所需原料要求相对简单，对微生物的生长所需的参数易控制，但其代谢产物的种类和含量不丰富，导致产品的风味物质不足。很多研究者通过构建多菌种的合成微生物群落制曲、发酵酱油，在制曲阶段选育多种遗传背景已知酿造微生物进行混合制曲，通过微生物间的相互交流和互补，来提高酱油产品风味和生物活性成分[29-30]。如PENG M Y等[31]研究发现，通过将米曲霉和黑曲霉（Aspergillus niger）混合制曲能够提高蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶的活力，增加了原料中蛋白质和淀粉的水解效果，同时在总酚含量、总黄酮含量、三种异黄酮苷元（大豆苷元、糖苷元、染料木素）和抗氧化活性方面，混菌发酵均高于纯种制曲发酵，这对提高酱油的产量和质量具有重要作用。

3.2 白酒生产应用

传统白酒的酿造属于典型的自然发酵，发酵体系中存在着以酵母为主的复杂微生物结构，然后通过这些微生物的生物转化完成了白酒的酿造。根据酵母在酿酒中的作用，可将酵母分为酿酒酵母和非酿酒酵母两大类。酿酒酵母具有较高的发酵速率和发酵能力，在白酒酿造中主要完成酒精的发酵，同时通过代谢作用能够产生高级醇类、酯类、有机酸等多种挥发性物质[32]。相对于酿酒酵母，非酿酒酵母虽然发酵能力较低，但具有较强的产酶能力，能够将原料中的前体物质经过一系列生化反应形成酸、酯、醛和高级醇等挥发性风味物质，同时这些菌在白酒发酵过程中还能有效抑制一些腐败菌的繁殖，这对提高白酒的品质有着重要作用[33-34]。随着白酒市场的不断扩大，人们对白酒品质的要求也更加严格，所以由传统的单一菌种酿造向混菌酿造方面成为了研究热点，有研究发现与酵母单独酿造相比，酵母混菌发酵出的白酒风味物质更加丰富[35-36]。如ZHA M S等[37]利用酿酒酵母和异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）混菌发酵酿造白酒，结果发现混菌发酵提高了酵母的细胞代谢活性，促进了发酵液中乙醇和乙酸乙酯的生成，从而有效改善了发酵液的风味特性，提高了白酒的品质。

3.3 食醋生产应用

食醋在酿造过程中由于原料和曲中微生物的自发富集形成了复杂的菌群结构，不同地区由于食醋群落结构的差异造成了食醋风味的差异。随着对食醋中微生物群落研究的深入，利用合成功能菌群来增强食醋中的风味特征和功能物质已获得突破[38]。乙偶姻是食醋的一种重要风味物质，也是食醋中活性成分川芎嗪的前体之一，其含量对食醋品质有着重要的影响[39]。为了提高食醋中乙偶姻的含量，可以通过向食醋中直接添加食品级的乙偶姻或者利用内源性微生物强化两种方法。而目前市面上销售的食品级乙偶姻多是通过化学方法合成不仅价格昂贵，而且直接添加也可能会因为化学物质的引入而影响食醋的安全性，因此采用内源性微生物强化的方法来提高乙偶姻的产量成为了研究热点，相较于前一种方法，这种方法不仅降低了乙偶姻的生产成本，而且更加健康安全[40-41]。已有研究揭示了巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianum）和5种乳酸菌（（短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、布氏乳杆菌（Lactobacillus brucei）和发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum））是合成乙偶姻相关的功能菌[42-43]。邱婷[44]以这6株功能菌株为研究对象，分别利用这几种乳酸菌和醋杆菌进行混菌发酵合成乙偶姻，结果发现与单菌种发酵相比干酪乳杆菌和巴氏醋杆菌构成混菌体系可显著提高乙偶姻含量，同时促进了酯类物质的积累，这为传统食醋中乙偶姻的强化生产指明方向，对提高食醋的品质有着重要的意义。

3.4 酸奶生产应用

由于传统的酸奶发酵过程开放程度高，容易滋生和感染各种杂菌，导致其发酵产物不稳定，影响了酸奶的品质。因此有研究者提出通过从优质酸奶中分离出其中的功能菌群并加以利用，来提高酸奶的品质[45-46]。酸奶中的风味物质主要来源于微生物对原料中乳糖、蛋白质的分解代谢，已有研究发现与单一的发酵剂相比，利用混菌作为发酵剂可有效改善酸奶的风味特性，提高酸奶的品质[47]。目前商业生产酸奶一般采用嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）混菌作为发酵剂，通过两种菌的协同作用加快了酸奶的酸化速率，提高了酸奶中芳香化合物的含量，增强了酸奶的营养价值[48]。随着对酸奶中益生菌研究的不断深入，发现胃酸和胆汁对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌具有较强的杀伤作用，使其无法在肠道内定植，从而使其有益作用受到了极大限制[49]。研究者通过模拟胃肠道实验发现嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）具有较强的胃酸和胆汁盐耐受性，可在肠道内大量存活，且嗜酸乳杆菌还具有较强产酸能力，适用于酸奶的发酵[50-51]。如李子叶等[52-53]以牛奶作为发酵基质，利用嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）混菌发酵酸奶，结果发现与未加嗜酸乳杆菌的发酵组相比其产酸速率更快，酸奶中的活菌数更多，乙醛等风味物质含量更高，同时嗜酸乳杆菌还具有降低胆固醇含量、增强人体免疫力的作用，这对酸奶的益生功能的进一步增强有着重要的意义。

4 总结和展望

合成的微生物群落不仅可控性高、稳定性好，而且还能够通过微生物之间的相互作用执行单一菌株难以完成的复杂任务，使其成了发酵食品领域研究的热点。中国传统的发酵食品属于典型的自然发酵，发酵过程中由于开放程度较高，使得发酵体系中微生物构成复杂，因此发酵完成不仅仅取决于单个微生物作用的叠加，还依赖着微生物间复杂的交互作用。现阶段对食品发酵微生物种群的作用关系和代谢网络的研究较少，想要调控微生物群落的发酵功能必须了解参与各种发酵生化反应的微生物，通过代谢网络模块化处理将发酵任务分解，确定关键微生物的单元任务，并通过调节发酵参数和强化菌株功能来实现调节微生物群落的代谢功能的目标。今后随着对于食品微生物群落的组成、功能和相互作用的深入研究，借助合成微生物群落的理论和研究方法，设计和构建出稳定高效的靶向精准的合成食品发酵微生物群落，将对我国发酵食品发展进步有着重要意义。