细胞块在宫颈液基细胞学腺上皮病变诊断中的临床应用价值*

余清，吴宁，贾世军，姚宇琪，侯俊，董浩

618000 四川 德阳，德阳市人民医院 病理科(余清、吴宁)；610041 成都，四川省肿瘤医院·研究所，四川省癌症防治中心，电子科技大学医学院 病理科(贾世军、姚宇琪、侯俊、董浩)

文献报道[1-3]宫颈鳞状上皮病变的发病率逐年降低，而宫颈腺癌的发病率则呈上升趋势，在宫颈癌中的比例由5%升至20%左右，液基细胞学(liquid-based cytology test，LCT)识别鳞状上皮病变的特异性较高，对腺上皮病变的诊断准确性却较低[4]。细胞块技术的基本原理是将细胞悬浮液离心，得到高度浓缩的细胞和微小的组织块，使用或不使用细胞块支架,再经10%中性福尔马林固定、常规脱水、石蜡包埋、切片、染色。细胞块比细胞涂片收集到更多的细胞成分,能恢复一定程度的组织学结构,且更清楚地显示肿瘤细胞的形态结构及细胞核的异型特征，制成的蜡块可以连续切片并长期保存,在细胞块基础上还可以进行免疫细胞化学(immunocytochemistry，ICC)标记和基因检测。目前细胞块常被用于非妇科细胞学检查，用于宫颈腺上皮病变的文献报道较少。本文以此为背景，探讨在LCT基础上加做细胞块及ICC检测在诊断宫颈腺上皮病变中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选取2019年1～12月LCT诊断腺上皮细胞异常病例共302例，均制备细胞块，其中来自四川省肿瘤医院172例，四川省德阳市人民医院130例，患者年龄31～74岁，平均(50.93±13.57)岁，均有组织学活检对照。

1.2 方法

1.2.1 LCT制备 暴露宫颈，用棉签擦去宫颈血液及分泌物，采用专用采样刷在宫颈肉眼可疑病变处保持适当压力同一方向旋转5～8圈，采集好后取下刷头放入美国BD公司专用妇科标本保存瓶内，BD公司PrepMate-PrepStain自动制片机制片。对不满意标本要求重新取样制片。

1.2.2 细胞块制备 1)在已完成LCT制片的标本保存瓶里加入蒸馏水10 mL，利用吸管反复冲洗出保存瓶内刷头上残余的细胞及小组织碎片，连同LCT制片完成后剩余的细胞一并放入15 mL离心管内，2 000 r/min离心10 min；2)用吸管轻轻吸去离心管内上清液，加入浓度为2.51 mmol/L海藻酸钠2 mL，于震荡仪上震荡10 s，2 000 r/min离心10 min；3)用吸管沿离心管内侧壁缓慢滴加浓度为18.02 mmol/L氯化钙1 mL，静置10 min；4)离心管底细胞聚集成团被变性的海藻酸钠包裹在内，外表形似果冻状，用镊子夹出，并用剪刀剪去表面多余的介质，随后置于包埋纸内，行常规脱水、石蜡包埋、切片、HE染色、镜检。

1.2.3 ICC检测 对LCT诊断的41例可疑腺癌用4 μm厚的细胞块石蜡切片做ICC染色：一抗p16、p53、WT1、ER、PR、CA125、PAX-8、CK7、CK20、SP-B、TTF-1、NapsinA购自福州迈新生物技术公司，二抗显色系统购自丹麦Dako公司，采用EnVision二步法，具体操作步骤按照说明书进行，用已知阳性标本作对照，用磷酸缓冲盐溶液代替一抗作阴性对照。

1.3 结果判断

细胞学诊断每张切片均由中、高级病理细胞学医师双人阅片，细胞块判读标准与组织学相同。

LCT判读标准根据2015年第三版Bethesda报告系统诊断报告模式[5]：1)未见腺上皮病变；2)腺上皮细胞异常：(1)非典型性腺细胞，无特殊指定，倾向反应性(atypical glandular cells, not otherwise specified， AGC-NOS)：来源于子宫颈管腺细胞、子宫内膜腺细胞；(2)非典型性腺细胞，倾向于瘤变(atypical glandular cells, favor neoplastic，AGC-FN)：来源于子宫颈管腺细胞或无法分类；(3)子宫颈管原位腺癌(adenocarcinoma in situ,AIS)；(4)腺癌：来源于子宫颈管腺癌、子宫内膜腺癌、子宫外腺癌。

ICC结果判读: TTF-1、ER、PR、PAX-8、p53、WT1以肿瘤细胞胞核出现棕黄色或深棕色颗粒为阳性， NapsinA、CK7、CK20、SP-B以肿瘤细胞胞浆出现棕黄色或深棕色颗粒为阳性，p16以肿瘤细胞胞浆和胞核出现棕黄色或深棕色颗粒为阳性，CA125以肿瘤细胞胞膜或胞浆出现棕黄色或深棕色颗粒为阳性。根据阳性细胞所占的百分率来判断：无着色为(-)，阳性细胞率<25%为(+)，25%～75%为(++)，>75%为(+++)。

2 结 果

2.1 302例组织学活检结果

恶性肿瘤49例(包括宫内膜腺癌31例、宫颈原发腺癌13例、卵巢浆液性癌4例、肺腺癌1例)，慢性炎症253例。

2.2 302例细胞学诊断

表1显示LCT诊断AGC-NOS 213例，AGC-FN 57例，AIS及腺癌32例; 细胞块诊断腺癌41例(包括宫内膜腺癌26例、宫颈原发腺癌12例、卵巢浆液性癌2例、肺腺癌1例)，未见腺上皮病变261例。根据诊断总符合率计算公式[6]：(真阳性+真阴性)/总例数，LCT与病理组织学诊断总符合率为86.09%(260/302)，细胞块与病理组织学诊断总符合率为97.35%(294/302)；根据特异性和敏感性的计算公式[6]，特异性=真阴性/(真阴性+假阳性)，敏感性=真阳性/(真阳性+假阴性)，LCT的特异性和敏感性分别为83.79%(212/253)、97.96%(48/49)；细胞块的特异性和敏感性分别为100%(253/253)、83.67%(41/49)。

表1 宫颈腺上皮病变细胞学诊断与组织学诊断对照

2.3 LCT和细胞块显微镜下特点及ICC结果

宫颈正常腺上皮在LCT中呈栅栏状或散在分布，可见小核仁，在细胞块中呈腺样排列，且柱状上皮细胞核位于基底部。腺癌在LCT中多呈三维立体结构或单个散在，在细胞块中呈腺样排列，具体特点及ICC结果见表2和图1。

表2 LCT、细胞块显微镜下特点及ICC结果

图1 腺癌在LCT和CB中的形态特点及ICC结果

3 讨 论

子宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤，是威胁亚洲妇女健康的第二大恶性肿瘤[7]。LCT是子宫颈癌及癌前病变的初筛法，存在一定的假阴性和假阳性[8]。近年来，细胞块应用于宫颈LCT的文献报道[8-11]多是在鳞状上皮病变内的研究。由于腺上皮受炎症、修复、化生、放化疗等因素影响易发生反应性改变，这一类良性反应性病变仅通过LCT很难与肿瘤性病变区分开，本文研究中LCT诊断与组织学诊断的总符合率为86.09%，其中LCT诊断的212例AGC-NOS、39例AGC-FN和2例AIS，组织学最终确诊为良性反应性改变。余小蒙[12]也认为在宫颈脱落细胞学诊断中包括子宫下段的取样、输卵管型上皮化生、修复、宫内节育器、子宫颈管息肉、微小腺体增殖、Aria-Stella反应和电离放射效应等其细胞形态特征可能貌似子宫颈腺上皮肿瘤，造成鉴别困难。

LCT不易辨别宫颈腺上皮良性反应性改变与腺上皮肿瘤，并且不能确定腺癌细胞的来源，我们将LCT制片完成后取样瓶内剩余液体标本离心收集细胞并通过海藻酸钠遇氯化钙迅速变性形成凝胶包裹住细胞的原理制备成细胞块。该方法操作简单，无需加热及反复多次离心，目前尚未见相关文献报道，对于宫颈LCT微量标本，通过该方法细胞数量得到最大程度收集且细胞形态保存较好。通过对本文302例细胞块切片阅片观察发现其结构清晰,背景干净，无血液、黏液、炎症细胞等干扰，细胞块中腺上皮细胞保留了接近于组织学的形态，并且通过离心高度浓缩恢复了一定的组织学结构特点，特别是腺癌细胞在细胞块中出现形似组织学的腺体结构，更容易被识别。本文研究中细胞块的敏感性为83.67%低于LCT的97.96%，但细胞块的特异性为100%高于LCT的83.79%，并且细胞块与组织学诊断的总符合率为97.35%高于LCT与组织学诊断的总符合率86.09%。与LCT对比，从细胞块镜下形态很容易识别出腺上皮受炎症、修复、化生、放化疗等因素影响导致的良性反应性改变，可对LCT诊断的非典型性腺细胞(atypical glandular cells，AGC)病例分流，避免不必要的宫颈活检术；另外，对于腺癌可用细胞块切片做ICC检测明确腺癌的来源，并且细胞块也为不耐受手术的晚期肿瘤患者的后续基因检测提供了条件。蓝旭丽[9]认为鉴于阴道镜活检取材的局限性，细胞块有明显优势，它可以把临床采集的几乎所有的细胞收集起来通过连续切片可能会看到阴道镜活检阴性的病变。本文研究中细胞块漏检8例(宫内膜腺癌5例，宫颈原发腺癌1例，卵巢浆液性癌2例)，其中3例宫内膜腺癌和2例卵巢浆液性癌通过细胞块连续切片并未查见肿瘤细胞，我们分析是由于卵巢和宫内膜癌从原发灶脱落并移到子宫颈口或阴道的肿瘤细胞数量较少，LCT制片完成后用于制备细胞块的剩余标本仅含有极其稀少的肿瘤细胞或者已无肿瘤细胞；另外2例宫内膜腺癌和1例宫颈原发腺癌通过连续切片后查见腺癌细胞。我们建议在制备细胞块时尽可能最大量的收集细胞成分，比如反复冲洗涮出保存瓶内刷头上残余的细胞及小组织碎片，另外需要注意在细胞块修片时少修并且连续切片8张以上以提高细胞块中的阳性发现。

宫颈脱落细胞学诊断腺癌时，我们在考虑宫颈原发病变的同时，也要考虑到有子宫内膜、卵巢和输卵管等邻近生殖器官恶性肿瘤脱落或累及的可能。文献报道[13]约30%的内膜癌、7%的卵巢癌患者的宫颈涂片中可以发现癌细胞，内膜癌比卵巢癌容易更早期出现于宫颈涂片中。内膜、卵巢等生殖道来源的癌细胞脱落或累及至宫颈时可以与原发宫颈癌的症状相似,临床症状上均表现为不规则阴道出血或排液，患者常规进行宫颈脱落细胞学检查，可以及早地发现内膜、卵巢等部位的肿瘤性病变。腺癌细胞从原发灶脱落又移到子宫颈口或阴道，恶性细胞常常退变明显，细胞清晰度不佳且细胞量较少，LCT通常表现为无特异性的三维立体或巢团状结构，而细胞块中可以查见更易辨识的典型形态学特征：如宫内膜样腺癌中由复层腺上皮围成的腺腔结构、卵巢浆液性癌的砂粒体结构等，在细胞块形态学基础上加做相关ICC检测就能进一步明确腺癌来源。另外，宫颈脱落细胞学查见腺癌细胞，除了生殖道来源外，还需要考虑到少见的子宫外肿瘤的转移。本文研究中确诊肺腺癌宫颈转移1例，肺腺癌宫颈转移国内外文献报道罕见，经过检索截止目前仅有6例[14-19]，本例既往有肺癌病史，且细胞块切片中的平铺状腺样结构不同于内膜及颈管腺癌，结合TTF-1(+)、NapsinA(+)、CK7(+)、SP-B(+)、CK20(-)支持肺腺癌宫颈转移的诊断。鉴别宫颈腺癌是原发还是子宫外远隔部位的转移十分重要，临床上宫颈的早期原发腺癌首选手术治疗、中晚期辅以放射治疗[20]，而子宫外肿瘤转移至宫颈，临床分期晚，治疗主要以针对原发灶的治疗为主。

综上所述，宫颈脱落细胞的细胞块制备操作简便、经济，细胞块具有形似组织学结构的特征并可在其基础上做ICC及基因检测，我们建议在宫颈细胞学筛查时，对LCT诊断腺上皮细胞异常病例可以常规制备细胞块进行联合检测。

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