保健食品中共轭亚油酸的气相色谱法测定

翁史昱，周静，麦成华，张申平

上海市质量监督检验技术研究院（上海 200233）

共轭亚油酸（CLA）是亚油酸异构体混合物的总称，其共轭双键以顺式或反式结构存在，目前发现的异构体有20种。2009年原卫生部第12号公告批准共轭亚油酸和共轭亚油酸甘油三酯为新资源食品，共轭亚油酸系列产品越来越受到人们的关注，关于其功能特性、应用和分析方法的研究也不断深入。研究发现CLA是一种无毒、无遗传突变的可食用性油脂，被誉为“21世纪绿色营养保健品”[1]。其具有抗动脉硬化[2]、减肥降脂[3-4]、抗癌[5]、抗炎[6-7]等生理功能，具有生物活性的异构体主要以9-cis, 11-trans CLA和10-trans, 12-cis CLA的形式存在[8-10]。

共轭亚油酸广泛分布在许多食品中，天然CLA主要存在于瘤胃动物牛、羊等的乳及肉制品脂肪中。牛奶是最丰富的天然CLA来源，平均每克牛奶的脂肪中CLA含量在2～37 mg之间[11]。针对共轭亚油酸采用的主要分析方法有气相色谱法[12-17]、高效液相色谱法[18-20]、紫外光谱法[21]和气质联用法（GC-MS）[22]等，或者几种方法一起使用，达到对共轭亚油酸异构体的分离和鉴别目的。气相色谱（GC）法是传统分析脂肪酸的方法，具有快速、高效、灵敏的优点，其分析结果准确度较高，稳定性好，国家和国际标准中都有方法规定[23-24]。通过GC分析CLA的研究报道已有不少，涉及牛乳制品[11-12,14]、驴乳[21]、牛羊乳脂[15,25]、牛肉[13]和芝麻[19]等中的含量检测，然而现阶段研究缺乏应用GC-FID法测定保健食品中CLA的研究，并且国标中尚未见保健食品中CLA的检测标准。试验针对保健食品中两种主要异构体9-cis, 11-trans CLA和10-trans,12-cis CLA的分析方法进行研究，建立2种异构体的准确、灵敏的定量分析方法，满足实际检测需求，为该领域的研究提供基础。

图1 共轭亚油酸化学结构式

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Agilent 7890A气相色谱质谱仪（配有氢火焰离子化检测器，美国Agilent公司）；SIGMA 3K30离心机（德国Sigma公司）；涡旋混合器（德国IKA公司）；SK8210LHC超声仪（上海科导超声仪器有限公司）；旋转蒸发仪（德国Heidolph公司）；万分位分析天平（美国DENVER公司）；Milli-Q超纯水器（美国Millipore公司）；DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；N-EVAPTM 111型吹氮浓缩仪（美国Organomation公司）。

9-cis, 11-trans CLA甲酯和10-trans, 12-cis CLA甲酯标准品（美国Nu-Chek公司）；十一碳酸甘油三酯（美国Sigma公司）。

甲醇、甲苯（色谱纯，Fisher公司）；乙酰氯、无水碳酸钠（分析纯，国药集团）；实验室用水为Milli-Q超纯水。

1.2 试验方法

1.2.1 溶液配制

共轭亚油酸甲酯标准储备液（10 mg/mL）：准确称取9-cis, 11-trans CLA甲酯和10-trans, 12-cis CLA甲酯标准品各200 mg置于20 mL容量瓶内，用甲苯定容混匀后制成标准储备液，于-20 ℃保存。

内标（十一碳酸甘油三酯）储备液（1.0 mg/mL）：准确称取100 mg十一碳酸甘油三酯置于100 mL容量瓶内，用甲苯混匀定容后，于4 ℃保存。

共轭亚油酸甲酯标准工作溶液：分别准确移取0.10，0.25，0.50，1.00和2.50 mL共轭亚油酸甲酯标准储备液于15 mL螺口玻璃管中，每个管中加入0.10 mL内标储备液。分别加入一定量甲苯定容至5.0 mL。得到共轭亚油酸甲酯质量浓度分别为200，500，1 000，2 000和5 000 mg/L的标准工作溶液。

乙酰氯-甲醇溶液（乙酰氯体积分数10%）：量取40 mL甲醇于100 mL干燥的烧杯中，准确吸取5.0 mL乙酰氯逐滴缓慢加入，不断搅拌，冷却后转移并定容至50 mL干燥的容量瓶中。临用前配制（乙酰氯为刺激性试剂，配制乙酰氯甲醇溶液时应不断搅拌防止喷溅，注意防护）。

碳酸钠溶液（6%）：准确称取6 g 无水碳酸钠于100 mL烧杯中，加水溶解，转移并用水定容至100 mL容量瓶中。

1.2.2 样品前处理

称取0.5 g样品（精确至0.1 mg），加入0.1 mL内标液置于15 mL螺口玻璃管中，在玻璃管中加入5 mL甲苯，加入6 mL 10%乙酰氯甲醇溶液，旋紧螺旋盖，置于80 ℃烘箱中加热2 h，取出冷却至室温。将反应后的样液转移至50 mL离心管中，分别用3.0 mL 6%碳酸钠溶液清洗玻璃管3次，合并碳酸钠溶液于50 mL离心管中，混匀，以5 000 r/min离心约3 min。取上清液作为试液，气相色谱仪测定。

1.2.3 仪器条件

气相色谱仪具有氢火焰离子化检测器（FID）；色谱柱为Supelco SP-2560（100 m×0.25 mm×0.2 μm）石英毛细管柱；载气为氮气，流量1.0 mL/min；进样方式为分流进样，分流比30∶1；进样口温度220 ℃；进样量0.2 μL；FID检测器温度300 ℃；燃烧室气体为氢气（40 mL/min）、空气（400 mL/min）；程序升温为100 ℃保持2 min，以5 ℃/min程序升温至210 ℃，以2 ℃/min升温至240 ℃，保持6 min，以10 ℃/min升温至245 ℃，保持9 min。

2 结果与分析

2.1 试验条件优化

由于CLA不稳定，很易转变成其他异构体，所以在测定前必须对样品进行甲酯化处理。食品安全国家标准GB 5009.168《食品中脂肪酸的测定》中涉及不同食品样品中脂肪酸甲酯化的方法通常有三氟化硼法、三甲基氢氧化硫法、酯交换法和乙酰氯-甲醇甲酯化方法[26]。这4种方法甲酯化效率不一，适用样品范围也不同。酸催化甲酯化方法在酯化过程中易产生其他异构体和含甲氧基反应产物，这些产物影响脂肪酸的分析，因此不太适合脂肪酸甲酯的制备；此外，升高温度及酯化反应时间也影响甲酯化产物。结果表明，相对其他几种方法，10%乙酰氯-甲醇法对于粉末状保健食品中的共轭亚油酸具有更好甲酯化效率。

在分析共轭亚油酸时，顺，反构型的共轭亚油酸异构体9-cis, 11-trans CLA甲酯和10-trans, 12-cis CLA甲酯在脂肪酸常规分析的Carbowax类型的固定相色谱柱上都可以分开，但其他的脂肪酸（C18∶1N9c和C18∶1N9T）会在60 m色谱柱上与这2个峰相重叠。为了得到更好分离效果，必须使用极性更强、柱长更长的毛细管柱[11]。该方法采用SP-2560这一极性非常强的脂肪酸甲酯测定专用毛细管柱分离、测定共轭亚油酸异构体，在实际粉末状保健食品测定的研究得到应用，说明所建立的试验条件准确可靠。

2.2 方法的线性范围及检出限

测定5个系列浓度的共轭亚油酸甲酯标准溶液，以内标校正标准曲线法定量测定。以目标化合物峰面积/内标物质峰面积的比值为纵坐标，以标准溶液浓度/内标物质浓度的比值为横坐标，绘制标准曲线。共轭亚油酸的具体标准曲线方程及相关系数见表1。

从表1看，在相同的检测条件下，9-cis, 11-trans CLA和10-trans, 12-cis CLA的系列标准质量浓度在200～5 000 mg/L时，线性相关系数r2均为0.999，能满足检测要求。

以被测物质的信噪比S/N≥3时的进样浓度定为检出限（LOD），S/N≥10时的进样浓度为定量限（LOQ）。在取样量0.5 g、定容体积5.0 mL前处理条件下，试验方法对9-cis, 11-trans CLA甲酯的定性检出限为0.594 g/100 g；定量检出限为1.98 g/100 g；对10-trans, 12-cis CLA甲酯的定性检出限为0.707 g/100 g；定量检出限为2.36 g/100 g。按照0.952 4的折算系数，折算9-cis, 11-trans CLA和10-trans, 12-cis CLA的定量检出限，分别为1.89和2.25 g/100 g。

表1 共轭亚油酸甲酯的回归方程、相关系数、线性范围和检出限

2.3 回收率及精密度试验

以1份保健食品为样品，在9，18和36 g/100 g 3个水平下进行加标回收试验。

参照GB/T 27417—2017附录A～C对于检测方法确认的技术要求，方法的回收率与精密度满足检测的要求。

表2 共轭亚油酸的加标回收率和相对标准偏差（n=6）

2.4 实际样品测定

图2 典型阳性样品的目标物色谱图

用该方法对2份粉末状保健食品中9-cis, 11-trans亚油酸和10-trans, 12-cis亚油酸进行检测，样品检出谱图见图2。具体检测结果显示，2份保健食品中的9-cis, 11-trans亚油酸分别为8.474和8.444 g/100 g；而10-trans, 12-cis亚油酸为8.825和8.804 g/100 g。

3 结论

通过优化衍生溶液体系，粉末状保健食品基质中2种共轭亚油酸物质的回收率得到有效提高，通过简化前处理步骤，优化色谱分离程序，建立回收率高、准确性高、稳定性强的保健食品中9-cis, 11-trans亚油酸和10-trans, 12-cis亚油酸的分析方法。该方法经实际样品检测证实，具有快速、准确、灵敏的特点，适合日常实验室批量测定保健食品中的共轭亚油酸。