双抗体夹心ELISA检测花生致敏蛋白Ara h 2的方法建立

王耀，刘胜男，邢荣花，张淑霞，王玲玲，郭保宝

1. 河南科技大学食品与生物工程学院（洛阳 471023）；2. 三门峡海关（三门峡 472000）；3. 安阳海关（安阳 455000）；4. 郑州海关技术中心（郑州 450002）；5. 三门峡市检验检疫中心（三门峡 472000）

随着生活水平的不断提高，消费者对食品安全程度的关注水平也发生了变化，不仅关注食源性致病菌、农兽药残留、违法添加等外源性问题，而且关注转基因、食物过敏等内源性问题。食物过敏是人体暴露于某种食物后反复发生，由特定免疫应答引起的不良反应[1]。致敏物质通常为食物中的蛋白质或糖蛋白[2]。近年来，食物过敏发病率呈现逐年上升趋势[3]，但由于缺乏有效治疗方法，患者只能通过避免食用含致敏物质的食物以防止过敏反应[4]。因此，很多国家通过颁布法规或标准，对食品标签中标识致敏物质进行强制要求[5]。中国现行食品安全国家标准——GB 7718—2011《预包装食品标签通则》中将致敏物质标识作为推荐内容，但在最新的修订征求意见稿中将致敏物质作为基本标示内容。因此，研究食品中致敏物质的高效快速、灵敏特异检测方法对于致敏物质标识监管、保障过敏消费者食品安全具有重要意义。

花生是八大主要致敏食物之一[6]，其含有多种致敏蛋白，因此花生及其制品在很多国家和地区的食品标签要求中被列为需要标识的致敏物质之一。已鉴定出的花生致敏蛋白有13种，其中Ara h 2是主要致敏蛋白之一，能被大多数花生过敏患者的血清识别[7]。Ara h 2占花生蛋白总量的5.9%～9.3%，由于结构中二硫键较多使其具有结构稳定、耐酶解的特点[8]。用于花生致敏物质检测的方法主要包括聚合酶链式反应（PCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和质谱法（MS）等方法[9]，其中PCR和ELISA是食品中致敏成分筛查中最常用的快速定性和定量分析方法[10]。PCR方法基于标志性基因进行检测，难以准确反映是否含有致敏物质[11]，而ELISA方法可直接针对致敏蛋白进行检测。试验基于所制备的Ara h 2兔源多抗和鼠源单抗，通过双抗体夹心检测原理，建立花生致敏蛋白Ara h 2的ELISA检测方法，并对其检测特性进行鉴定，以期为食品标签中致敏物质标识的高效监管提供支撑，更好地保障过敏消费者的食品安全。

1 材料与方法

1.1 试剂与溶液

花生致敏蛋白Ara h 1、Ara h 2（美国INDOOR生物技术公司）；大豆球蛋白、卵清蛋白、酪蛋白、牛血清蛋白、3, 3’, 5, 5’-四甲基联苯胺（美国Sigma-Aldrich试剂公司）；HRP标记的山羊抗兔IgG抗体（索莱宝生物科技公司）；Ara h 2鼠源单抗、Ara h 2兔源多抗及超纯水由实验室制备；其他试剂（均为市售分析级）。

ELISA包被液采用0.05 mol/L碳酸盐缓冲液（CBS）；稀释液采用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）；洗涤液含0.05% tween-20的PBS（PBST）；封闭液含5%脱脂奶的PBST溶液；显色液采用3, 3’, 5,5’-四甲基联苯胺（TMB）缓冲液；终止液采用2 mol/L H2SO4溶液。

1.2 仪器与设备

BSA224S型电子天平（德国Sartorius公司）；Multiskan FC型酶标仪（美国Thermo Scientific公司）；Vortex2型振荡器（艾卡仪器设备有限公司）；SZCL-2型控温磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；HPX-9052MBE型恒温培养箱（上海博迅实业有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 双抗体夹心ELISA基本步骤

利用Ara h 2 鼠源单抗（mAb）作为捕获抗体，用于ELISA酶标板的包被。将mAb用CBS稀释，加入100 μL/孔酶标板，4 ℃条件下包被过夜；洗板，即用PBST冲洗酶标板4次并拍干（下同），拍干后将封闭液加入200 μL/孔酶标板，37 ℃条件下封闭1 h；洗板并将包被好的酶标板在4 ℃条件下密封保存备用。

进行检测时，将样液加入100 μL/孔酶标板，同时设置阴性孔（加入PBS 100 μL），37 ℃条件下孵育1 h后洗板；利用Ara h 2 兔源多抗（pAb）作为检测抗体，将pAb用封闭液稀释，加入100 μL/孔酶标板，37 ℃条件下孵育30 min后洗板；将HRP标记的山羊抗兔IgG抗体（GaRIgG-HRP）用封闭液按1∶5 000倍稀释，加入100 μL/孔酶标板，37 ℃条件下孵育30 min后洗板；将显色液加入100 μL/孔酶标板，室温静置反应10 min；将终止液加入100 μL/孔酶标板终止反应，并用酶标仪读取各孔OD450nm值。

1.3.2 捕获抗体和检测抗体工作浓度的优化

采用棋盘法优化抗体工作浓度[12]。将mAb用CBS稀释为1∶5 000，1∶10 000，1∶15 000和1∶20 000这4个稀释度，每个稀释度100 μL/孔包被酶标板2行（包被程序同上）。将确定浓度的Ara h 2标准溶液加入第1行100 μL/孔，将PBS作为阴性对照加入第2行100 μL/孔，37 ℃条件下孵育1 h后洗板；将pAb用封闭液稀释为1∶5 000，1∶10 000，1∶15 000和1∶20 000这4个稀释度，每个稀释度100 μL/孔加入3列酶标板，37 ℃条件下孵育30 min后洗板；加入GaRIgG-HRP孵育，显色、终止并读取OD450nm值。得到各稀释度下测定Ara h 2标准溶液的OD450nm平均值（P值）和阴性对照的OD450nm平均值（N值），将P/N最大时所对应mAb和pAb的稀释度分别作为捕获抗体和检测抗体的最佳工作浓度。

1.3.3 方法检测特性鉴定

1.3.3.1 灵敏度鉴定

灵敏度通过方法的检测限（LOD）确定，检测限越低，则灵敏度越高。利用优化抗体工作浓度后的双抗体夹心ELISA对一系列梯度浓度的Ara h 2标准溶液进行检测。将各标准溶液浓度对数值作为横坐标，检测所得OD450nm值作为纵坐标，得到双抗体夹心ELISA的标准曲线。重复检测20次空白样品，根据标准曲线的线性回归方程计算求得浓度，计算浓度平均值（X）和标准差（δSD），以X+3δSD作为方法的检测限[13]。

1.3.3.2 准确度鉴定

将5%脱脂奶作为添加基质，向其中加入Ara h 2标准品溶液，配制成不同添加浓度的样品，利用双抗体夹心ELISA对每个浓度样品重复检测6次，通过计算添加回收试验的平均回收率及变异系数（CV）以鉴定方法的准确度[14]。

1.3.3.3 特异性鉴定

通过交叉反应试验鉴定方法的特异性[15]。分别配制高浓度的花生致敏蛋白Ara h 1、大豆球蛋白、卵清蛋白、酪蛋白、牛血清蛋白等其他常见致敏蛋白溶液，利用双抗体夹心ELISA检测并设置阴性对照。若其他致敏蛋白的OD450nm值（P值）和阴性对照OD450nm值（N值）的比值P/N小于2.1，则说明与其他致敏蛋白无交叉反应，特异性良好。

1.3.3.4 稳定性鉴定

将已包被mAb的酶标板在4 ℃条件下避光密封保存，分别在保存的0，30，60和90 d时，利用双抗体夹心ELISA检测特定浓度的Ara h 2标准溶液并设置阴性对照，计算P/N值，通过对比不同保存时间检测所得P/N值的差异鉴定方法的稳定性[16]。

2 结果与分析

2.1 捕获抗体和检测抗体的工作浓度

利用已包被不同稀释度mAb的酶标板进行棋盘试验，通过不同稀释度的pAb对50 ng/mL的Ara h 2标准溶液及阴性对照进行检测，根据所得到的不同抗体稀释度对应的OD450nm值计算P/N值。结果如表1所示，mAb以1∶15 000稀释包被酶标板，pAb以1∶10 000稀释进行检测时，计算所得P/N值最大，因此捕获抗体mAb和检测抗体pAb最佳工作浓度分别为1∶15 000稀释和1∶10 000稀释。

表1 捕获抗体和检测抗体工作浓度的优化

2.2 灵敏度

配制1，2，4，8，16，32，64，128和256 ng/mL的Ara h 2标准溶液用于建立方法标准曲线。以各标准溶液浓度的对数值为横坐标，以检测所得OD450nm值为纵坐标，得到如图1所示的标准曲线，其线性范围为2～128 ng/mL，回归方程为y=1.348 6x-0.368 6（R2=0.986 7）。通过重复检测空白样品，计算检测结果平均值（X）和标准差（δSD），方法检测限X+3δSD为2.32ng/mL，说明双抗体夹心ELISA的灵敏度较高。

2.3 准确度

分别配制10，50和100 ng/mL 3个Ara h 2添加浓度5%脱脂奶溶液样品，利用双抗体夹心ELISA对每个添加浓度的样品进行6次重复检测。各添加浓度溶液样品的平均回收率及CV结果如表2所示。回收率处于87.6%～93.3%，CV处于7.3%～10.7%，表明方法准确度较高。

图1 双抗体夹心ELISA标准曲线

表2 双抗体夹心ELISA准确度鉴定结果

2.4 特异性

分别配制质量浓度为200 ng/mL花生致敏蛋白Ara h 1、大豆球蛋白、卵清蛋白、酪蛋白和牛血清蛋白溶液。利用双抗体夹心ELISA检测所得OD450nm值（P值）和阴性对照OD450nm值（N值）结果如表3所示。各致敏蛋白的P/N值均小于2.1，说明方法与其他常见致敏蛋白无交叉反应，具有较强的特异性。

表3 双抗体夹心ELISA特异性鉴定结果

2.5 稳定性

利用双抗体夹心ELISA分别在已包被mAb酶标板保存的0，30，60和90 d检测50 ng/mL的Ara h 2标准溶液，P值和N值结果如表4所示，在不同保存时间，P/N值均无较大变化，表明在4 ℃避光密封保存条件下，酶标板可稳定保存至少90 d，说明方法具有良好稳定性。

表4 双抗体夹心ELISA检测方法稳定性鉴定结果

3 结论

依据双抗体夹心ELISA原理，利用Ara h 2鼠源mAb作为捕获抗体，提高对于单一致敏蛋白的高亲和力特异性捕获能力，以Ara h 2兔源pAb作为夹心检测抗体，增强对致敏蛋白的高效识别，建立可灵敏准确、特异稳定的检测花生致敏蛋白Ara h 2的双抗体夹心ELISA方法。通过对检测特性进行鉴定，方法检测限为2.32 ng/mL，添加回收试验回收率为87.6%～93.3%，方法与其他致敏蛋白无交叉反应，且可在4 ℃避光密封条件下保持90 d内检测结果稳定。试验方法与已有的基于多抗研制的商品化ELISA试剂盒相比[17]，在灵敏度和特异性上表现出一定优势，可用于食品标签中花生致敏物质标识信息的快速筛查，为食品安全监管提供高效的监测手段和技术支撑。