高灵敏小鼠免疫球蛋白IgG的ELISA检测方法的构建

宋秀春，汤迎春，杨 夏

(1.内蒙古呼伦贝尔市人民医院，内蒙古 海拉尔 021008；2.内蒙古包钢医院，内蒙古 包头 014010)



高灵敏小鼠免疫球蛋白IgG的ELISA检测方法的构建

宋秀春1,2，汤迎春1，杨 夏2

(1.内蒙古呼伦贝尔市人民医院，内蒙古 海拉尔 021008；2.内蒙古包钢医院，内蒙古 包头 014010)

目的 为从天然化合物中高效筛选具有体液免疫抑制活性的先导化合物，本研究将构建高灵敏且价格低廉的小鼠免疫球蛋白IgG的ELISA检测方法。方法 利用山羊抗小鼠IgG的Fc段抗体、生物素标记的山羊抗小鼠IgG的F(ab’)2段抗体、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素构建小鼠免疫球蛋白IgG的ELISA检测方法；通过对包被抗体浓度、检测抗体浓度和链霉亲和素浓度的优化，使检测方法灵敏度达到最高；再利用该检测方法检测体外培养小鼠B细胞上清中IgG浓度验证方法的有效性。结果 在山羊抗小鼠IgG的Fc段抗体浓度达到5 μg·mL-1，生物素标记的山羊抗小鼠IgG的F(ab’)2段抗体浓度达到0.25 μg·mL-1，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素浓度达到0.5 μg·mL-1，小鼠免疫球蛋白IgG的ELISA检测方法灵敏度达到最高(0.05 ng·mL-1)，线性范围在0.1～10 ng·mL-1；该检测方法可以高灵敏检测体外培养LPS刺激小鼠B细胞分泌的IgG抗体。结论 本研究成功构建高灵敏且价格低廉的小鼠免疫球蛋白IgG的ELISA检测方法。

小鼠免疫球蛋白；IgG；ELISA；灵敏度

自身免疫性疾病、过敏性疾病和器官移植排斥是严重危害人类健康的免疫失调性疾病，目前临床主要应用糖皮质激素、环孢素、他克莫司等免疫抑制剂对其进行治疗。由于这些常用免疫抑制剂缺乏特异性，可导致代谢紊乱、血液毒性和肝肾毒性等不良反应，严重影响了上述疾病的治疗[1-3]。传统医学中已发现很多中药或方剂具有祛风除湿、清热燥湿、温经散寒、通络止痛之功效，对自身免疫性疾病和过敏性疾病具有治疗作用。现代医学表明这种作用可能来自中药的免疫抑制活性[4-7]。因此，从中药中发现具有全新作用机制的高效低毒免疫抑制剂先导化合物具有重要研究意义。

根据传统医学中中药及其方剂的药效导向，利用现代分离和结构鉴定方法，可获得大量全新结构的具有潜在生物活性的化合物。利用传统的动物模型对种类繁多的微量化合物进行活性筛选已难以满足实际需要。近年来，体外细胞药效筛选已逐渐成为天然化合物活性筛选的主要模式[8-11]。免疫抑制剂体外筛选需要测定多种指标，其中B细胞分泌的IgG是筛选该类抑制剂的核心指标。然而，由于已有的小鼠IgG的ELISA测定试剂盒灵敏度低且价格昂贵，极大地限制了免疫抑制剂的筛选。为充分发掘中药资源，高效筛选免疫抑制剂先导化合物，本研究将构建灵敏度高且价格低廉的小鼠IgG的ELISA检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

8周龄雄性Balb/c小鼠，购自北京维通利华实验动物有限公司。

1.1.2 试剂

RPMI1640培养基(货号：10-010-CVR)、胎牛血清(货号：35-076-CV)、0.25%胰酶(货号：25-253-CI)、氨苄青霉素和链霉素(货号：30-002-CI)，购自美国Corning公司；红细胞裂解液(货号：CC051)，购自北京迈晨科技有限公司；脂多糖(货号：L2880)、牛血清白蛋白(货号：V900933)、吐温20(货号：P1379)购自Sigma-Aldrich公司；山羊抗小鼠IgG的Fc段抗体(货号：SA0102)、生物素标记的山羊抗小鼠IgG的F(ab’)2段抗体(货号：SA0103B)和辣根过氧化物酶标记链酶亲和素(货号：BR0001)，购自北京佰瑞达生物科技有限公司；单组份TMB显色液(货号：PR1200)，购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 检测范围的初步评估

将山羊抗小鼠IgG的Fc段抗体(10 μg·mL-1)加入96孔酶标板中，每孔100 μL，4 ℃包被过夜；利用清洗液(含0.1%吐温20的PBS)清洗酶标板3次后，将封闭液(含1%BSA的PBS)加入酶标板中，37 ℃封闭2 h；倒去封闭液，加入封闭液稀释的系列浓度小鼠IgG(0.001～1 000 ng·mL-1)，37 ℃反应1 h；利用清洗液清洗酶标板3次后，加入抗体稀释液(含0.1%吐温20和1%BSA的PBS)稀释的生物素标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG的F(ab’)2段抗体(1 μg·mL-1)，37 ℃反应1 h；利用清洗液清洗酶标板3次后，加入抗体稀释液稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP-SA，2 μg·mL-1)，37 ℃反应0.5 h；利用清洗液清洗酶标板5次后，加入TMB底物进行显色；加入终止液(含10%浓盐酸的蒸馏水)后，450 nm测定吸光度。

1.2.2 包被抗体浓度优化

将0.1～100 μg·mL-1山羊抗小鼠IgG的Fc段抗体加入96孔酶标板中，每孔100 μL，4 ℃包被过夜；利用清洗液清洗酶标板3次后，将封闭液加入酶标板中，37 ℃封闭2 h；倒去封闭液，加入利用封闭液稀释的小鼠IgG(5 ng·mL-1)，37 ℃反应1 h；利用清洗液清洗酶标板3次后，加入抗体稀释液稀释的生物素标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG的F(ab’)2段抗体(1 μg·mL-1)，37 ℃反应1 h；利用清洗液清洗酶标板3次后，加入抗体稀释液稀释的HRP-SA(2 μg·mL-1)，37 ℃反应0.5 h；利用清洗液清洗酶标板5次后，加入TMB底物进行显色；加入终止液后，450 nm测定吸光度。1.2.3 检测抗体浓度优化

将山羊抗小鼠IgG的Fc段抗体(5 μg·mL-1)加入96孔酶标板中，每孔100 μL，4 ℃包被过夜；利用清洗液清洗酶标板3次后，将封闭液加入酶标板中，37 ℃封闭2 h；倒去封闭液，加入封闭液稀释的小鼠IgG(5 ng·mL-1)，37 ℃反应1 h；利用清洗液清洗酶标板3次后，加入抗体稀释液稀释的生物素标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG的F(ab’)2段抗体(0.01～10 μg·mL-1)，37 ℃反应1 h；利用清洗液清洗酶标板3次后，加入抗体稀释液稀释的HRP-SA(2 μg·mL-1)，37 ℃反应0.5 h；利用清洗液清洗酶标板5次后，加入TMB底物进行显色；加入终止液后，450 nm测定吸光度。1.2.4 HRP-SA浓度的优化

将山羊抗小鼠IgG的Fc段抗体(5 μg·mL-1)加入96孔酶标板中，每孔100 μL，4 ℃包被过夜；利用清洗液清洗酶标板3次后，将封闭液加入酶标板中，37 ℃封闭2 h；倒去封闭液，加入封闭液稀释的小鼠IgG(5 ng·mL-1)，37 ℃反应1 h；利用清洗液清洗酶标板3次后，加入抗体稀释液稀释的生物素标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG的F(ab’)2段抗体(0.25 μg·mL-1)，37 ℃反应1 h；利用清洗液清洗酶标板3次后，加入抗体稀释液稀释的HRP-SA(0.01～10 μg·mL-1)，37 ℃反应0.5 h；利用清洗液清洗酶标板5次后，加入TMB底物进行显色；加入终止液后，450 nm测定吸光度。1.2.5 标准曲线测定

将山羊抗小鼠IgG的Fc段抗体(5 μg·mL-1)加入96孔酶标板中，每孔100 μL，4 ℃包被过夜；利用清洗液清洗酶标板3次后，将封闭液加入酶标板中，37 ℃封闭2 h；倒去封闭液，加入封闭液稀释的系列浓度小鼠IgG(0.01～10 ng)，37 ℃反应1 h；利用清洗液清洗酶标板3次后，加入抗体稀释液稀释的生物素标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG的F(ab’)2段抗体(0.25 μg·mL-1)，37 ℃反应1 h；利用清洗液清洗酶标板3次后，加入抗体稀释液稀释的HRP-SA(0.5 μg·mL-1)，37 ℃反应0.5 h；利用清洗液清洗酶标板5次后，加入TMB底物进行显色；加入终止液后，450 nm测定吸光度。

1.2.6 B细胞分泌抗体的浓度测定

颈椎脱臼处死Balb/c小鼠，利用75%乙醇浸泡5 min，无菌超净台内取小鼠脾脏；将小鼠脾脏放入70 μM无菌滤网中，5 mL注射器内芯研磨，并用20 mL PBS冲洗，获得小鼠脾脏细胞悬液；300 g离心5 min，弃上清，加入10 mL红细胞裂解液裂解红细胞，再加入20 mL RPMI1640培养基终止裂解，300 g离心5 min，弃上清；再利用10 mL的含10%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬细胞，300 g离心5 min，弃上清；最后利用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬细胞(含氨苄青霉素和链霉素)，并进行计数。将细胞接种到96孔培养板中(2×105个/孔)，加入LPS(10 μg·mL-1)，0～72 h内多个时间点收集细胞上清，利用上述ELISA方法测定细胞培养上清中的小鼠IgG。1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 小鼠IgG的检测范围

为确定适合的小鼠IgG浓度用于后续测定条件优化，首先需要在常规检测条件下确定小鼠IgG的检测范围。经初步研究，确定小鼠IgG的检测范围为0.1～100 ng·mL-1(图1)。

图1 小鼠IgG的定量范围

注：利用山羊抗小鼠IgG的Fc段抗体(10 μg·mL-1)包被96孔酶标板；经清洗和封闭后，加入封闭液稀释的系列浓度小鼠IgG(0.001～1 000 ng·mL-1)，37 ℃反应1 h；经清洗酶标板后，加入生物素标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG的F(ab’)2段抗体(1μg·mL-1)，37 ℃反应1 h；清洗酶标板后，加入HRP-SA(2 μg·mL-1)，37 ℃反应0.5 h；再经清洗酶标板后，加入TMB底物进行显色10 min；最后加入终止液，450 nm测定吸光度。

2.2 包被抗体浓度对测定的影响

初步评估小鼠IgG检测范围后，选择5 ng·mL-1的小鼠IgG进行后续检测条件优化。通过对不同浓度包被抗体的研究，发现包被抗体浓度≥5 μg·mL-1时，检测灵敏度达到最大(图2)。

图2 包被抗体浓度对测定的影响

注：利用山羊抗小鼠IgG的Fc段抗体(0.1～100 μg·mL-1)包被96孔酶标板中；经清洗和封闭后，加入5 ng·mL-1小鼠IgG，37 ℃反应1 h；经清洗酶标板后，加入生物素标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG的F(ab’)2段抗体(1μg·mL-1)，37 ℃反应1 h；清洗酶标板后，加入HRP-SA(2 μg·mL-1)，37 ℃反应0.5 h；再经清洗酶标板后，加入TMB底物进行显色10 min；最后加入终止液，450 nm测定吸光度。*P<0.05与包被抗体浓度为100 μg·mL-1的A450比较。

2.3 检测抗体浓度对测定的影响

经过初步的小鼠IgG检测范围的评估和包被抗体浓度的优化，选取5 ng·mL-1的小鼠IgG、5 μg·mL-1的包被抗体浓度进行后续测定。通过对不同浓度检测抗体的研究，发现检测抗体浓度≥0.25 μg·mL-1时，可使检测灵敏度达到最大(与最高检测抗体浓度相比)(图3)。

图3 检测抗体浓度对测定的影响

注：利用5 μg·mL-1山羊抗小鼠IgG的Fc段抗体包被96孔酶标板中；经清洗和封闭后，加入5 ng·mL-1小鼠IgG，37 ℃反应1 h；经清洗酶标板后，加入系列浓度生物素标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG的F(ab’)2段抗体(0.01～10 μg·mL-1)，37 ℃反应1 h；清洗酶标板后，加入HRP-SA(2 μg·mL-1)，37 ℃反应0.5 h；再经清洗酶标板后，加入TMB底物进行显色10 min；最后加入终止液，450 nm测定吸光度。*P<0.05与检测抗体浓度为10 μg·mL-1的A450比较。

2.4 HRP-SA浓度对测定的影响

在确定了合适的包被抗体和检测抗体浓度后，本研究进一步对HRP-SP浓度进行优化，发现HRP-SP浓度≥0.5μg·mL-1时，能使检测灵敏度达到最大值(图4)。

图4 HRP-SA浓度对测定的影响

注：利用5 μg·mL-1山羊抗小鼠IgG的Fc段抗体包被96孔酶标板中；经清洗和封闭后，加入5 ng·mL-1小鼠IgG，37 ℃反应1 h；经清洗酶标板后，加入0.25 μg·mL-1生物素标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG的F(ab’)2段抗体，37 ℃反应1 h；清洗酶标板后，加入系列浓度HRP-SA(0.01～10μg·mL-1)，37 ℃反应0.5 h；再经清洗酶标板后，加入TMB底物进行显色10 min；最后加入终止液，450 nm测定吸光度。*P<0.05与HRP-SA浓度为10 μg·mL-1时的A450比较。

2.5 标准曲线的测定

利用优化的测定条件对小鼠IgG进行标准曲线测定，以确定测定灵敏度和线性范围。结果显示该检测方法灵敏度可达0.05 ng·mL-1，线性范围为0.1～10 ng·mL-1(图5)。

图5 标准曲线测定

注：利用5 μg·mL-1山羊抗小鼠IgG的Fc段抗体包被96孔酶标板；经清洗和封闭后，加入0.01～100 ng·mL-1小鼠IgG，37 ℃反应1 h；经清洗酶标板后，加入0.25 μg·mL-1生物素标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白IgG的F(ab’)2段抗体，37 ℃反应1 h；清洗酶标板后，加入0.5 μg·mL-1的HRP-SA，37 ℃反应0.5 h；再经清洗酶标板后，加入TMB底物进行显色10 min；最后加入终止液，450 nm测定吸光度。

2.6 B细胞分泌IgG的测定

在经过测定条件优化和标准曲线测定后，本研究对体外培养小鼠B细胞分泌的IgG进行测定，以验证测定方法的有效性。结果显示该检测方法可以准确检测出B细胞在不同刺激时间后分泌的IgG(图6)。

3 讨 论

传统的小鼠IgG检测主要采用免疫沉淀法和免疫比浊法。这2类方法虽然比较廉价，但其灵敏度、定量能力较差，测定通量过低。近年来，通过

图6 B细胞分泌IgG的测定

注：体外培养小鼠脾脏B细胞；利用10 μg·mL-1浓度的LPS刺激B细胞分泌抗体；在0～72 h的多个时间点收集细胞培养上清，利用上述优化后的检测条件测定IgG浓度。

ELISA方法检测小鼠IgG已经成为广泛应用的定量方法，其定量准确和高通量特性非常适合药物先导化合物的筛选。但由于抗抗体与IgG的同源性，它们的结合能力具有效价低的天然特性。因此，目前市售的检测小鼠IgG的ELISA试剂盒普遍灵敏度偏低(例如ebioscience公司检测小鼠IgG的ELISA试剂盒灵敏度为1.56 ng，武汉华美生物工程有限公司检测小鼠IgG的ELISA试剂盒灵敏度为29 ng)，仅能用于体内IgG检测和含高浓度IgG的体外细胞上清检测。在药物先导化合物的筛选和机制研究中，经常要对少量B细胞在不同刺激剂和刺激时间下分泌的微量IgG进行检测，而已有的试剂盒灵敏度难以满足实验需要。

本研究主要利用双抗夹心法检测小鼠IgG，相对竞争法能够显著提高灵敏度，改善定量准确性。通过分别针对小鼠IgG的Fc段和F(ab’)2段二抗的双抗夹心法可以避免包被抗体和检测抗体的交叉反应，降低生物素标记的检测抗体浓度，从而降低检测背景，提高检测灵敏度。另外生物素和亲和素结合反应可以进一步提高检测灵敏度。

在改进检测方法设计后，本研究通过进一步优化包被抗体浓度、检测抗体浓度、HRP-SA浓度，将检测方法的灵敏度提高到0.05 ng·mL-1，线性范围达到0.1～10 ng。相对于国内外市售试剂盒，本检测方法显著提高了小鼠IgG的检测灵敏度和定量特性，并且检测方法成本仅相当于市售试剂盒的1/10～1/50。

本研究成功构建了高灵敏且价格低廉的小鼠IgG的ELISA检测方法，非常适用于免疫抑制剂先导化合物的筛选及其作用机制研究。

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[责任编辑：李蓟龙 英文编辑：刘彦哲]

Construction of High Sensitivity Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Mouse IgG

SONG Xiu-chun1,2，TANG Ying-chun1，YANG Xia2

(1.Hulunbeier People’s Hospital,Hailaer,Inner Mongolia 021008,China; 2.Baogang Hospital,Baotou,Inner Mongolia 100050,China)

Objective To efficiently and reliably screen natural compounds for lead compounds with immunosuppressive activity,high sensitivity and low-cost enzyme-linked immunosorbent assay for mouse IgG was constructed.Methods Goat antibody specific to Fc fragment of mouse IgG,goat antibody specific to F(ab’)2 fragment of mouse IgG,and horseradish peroxidase-labeled streptavidin(HRP-SA)were used to construct ELISA for mouse IgG.The concentration of capture antibody,detection antibody and HRP-SA were optimized to improve the sensitivity of this assay.Then to validate this method,the assay was used to determine the level of mouse IgG secreted by B cells culturedinvitro.Results While the concentration of capture antibody reached 5 μg/ml,the concentration of detection antibody reached 0.25 μg/ml,and HRP-SA reached 0.5 μg/ml,the highest sensitivity was achieved(0.05 ng/ml)and the linear range was from 0.1 to 10 ng/ml.This assay could be used to determine the level of mouse IgG secreted by B cells cultured in vitro with high sensitivity.Conclusion This study successfully constructed high sensitivity and low-cost ELISA for mouse IgG.

mouse immunoglobulin;IgG;ELISA;sensitivity

内蒙古医科大学第三临床医学院医学研究基金项目(NO.2014-24)

宋秀春(1980-)，女，护士长，主管护师。

杨夏(1984-)，女，硕士，主管药师，研究方向：药品质量控制方法学。

R 730.45

A

10.3969/j.issn.1673-1492.2017.08.003

来稿日期：2016-12-19