捕食动物线虫性真菌相关研究进展

侯 斌，母晓佳，牛杰康，尚世杰，樊雅茹，丁玉林，王 瑞*，杜 山*

(1.内蒙古农业大学兽医学院/农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室/国家级动物医学实验教学中心，内蒙古呼和浩特 010010；2.内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古呼和浩特 010018)

畜禽线虫病是由线形动物门中的多种线虫寄生于畜禽体内引起的一类寄生虫病，对畜禽危害十分严重，可明显降低畜禽养殖业的经济效益，并严重阻碍畜牧业的持续发展。一直以来，针对这类疾病，主要是采用广谱抗寄生虫药物驱虫来进行防治，但这一手段已暴露出越来越多的问题，诸如耐药虫株的产生使得化学药物的防治效果逐年下降甚至丧失、动物源性食品的药物残留及环境污染等。这些问题已引起寄生虫学领域相关学者的重视，并开始积极探索新的防治手段。生物防治便是其中非常具有应用潜力的一种，在畜禽线虫病的生物防治中，很重要的一个方面就是利用存在于自然界的线虫天敌——捕食线虫性真菌进行生物控制。

捕食线虫性真菌是一类广泛存在于自然界生态系统中的真菌，从热带地区到寒冷的南极洲，从陆地到水生生态系统，均发现有捕食线虫性真菌存在[1]。它能够将营养菌丝特化形成捕食器，捕获自由生活的线虫并从线虫体摄取营养，因而在调节环境线虫动态数量中起着重要的生态作用。大多数捕食线虫性真菌既能进行寄生生活也能营腐生生活，从生物进化的角度来讲，能够进行兼性寄生的真菌比单纯腐生真菌具有更强的适应能力，且具有更广阔的应用前景。捕食线虫性真菌的研究开端以Corda于1839年发现ArthrobotrysCorda为标志。自从被发现以来，国内外许多学者已在其捕食特性、生化机制及临床应用等方面做了大量研究工作，但究竟研究了哪些内容和进展到什么程度，未见相关综述报道。因此，本文在查阅大量文献的基础上，详细综述了近10年来捕食线虫性真菌的捕食活性、捕食器的形成、真菌基因组学及相关捕食机制、捕食相关活性物质及应用模式等的研究进展，既是对之前研究工作的总结，也为今后有关捕食性真菌的深入研究提供参考。

1 捕食线虫性真菌捕食活性的研究

1939年，Roubaud等发现隔指孢菌属真菌(Dactylella)对类圆属及钩口属线虫的幼虫具有杀伤作用，这是最早利用捕食线虫性真菌防治动物寄生性线虫的报道。此后，不断有新的菌种被发现，目前已报道有多达200余种真菌,主要分布在真菌届(Eumycota)的担子菌门(Basidiomycota)、子囊菌门(Ascomycota)和接合菌门(Zygomycota)等的12个属中，如三叉孢属(Tridentaria)、隔指孢菌属(Dactylella)、梗虫霉属(Stylopage)和节丛孢属(Arthrobotrys)等。随着研究的逐步深入，人们发现同一菌种对不同的线虫均有捕食能力，且相同菌种的不同菌株对同一线虫的捕食能力也呈现不同[2]。考虑到临床应用的需要，选择环境耐受力强、捕食效率高、捕食幼虫谱广及易于培养的菌株作为研究对象才更有意义[3]。因此，有关捕食性真菌的分离与捕食活性方面的研究为接下来的工作奠定了坚实的基础，并一直在持续进行。

Silva A R等[4]对4种捕食线虫性真菌Duddingtoniaflagrans、Monacrosporiumthaumasium、Monacrosporiumsinense和Arthrobotrysrobusta捕食锡兰钩虫感染性幼虫(L3)的活性进行了研究，将4种菌株与锡兰钩虫的L3一起培养在20 g/L琼脂培养基上，7 d后观察到L3平均分别降低了95.6%、85.1%、87.4%、90.2%，证明4种捕食性真菌都能有效地在体外捕获锡兰钩虫L3，与JOAN M B等所报道的结果一致[5]。Ojeda R N F等[6]从墨西哥东南部的水牛粪便和土壤中分离出了4株A.oligospora，其对捻转血矛线虫L3的捕食活性在85.9%～100%之间。另据Zarrin M等[7]报道，F.solani、V.chlamidosporium及T.harzianum对马圆线虫的L3也有较高的捕食活性。在这些真菌中,D.flagrans已被证明能顺利通过动物消化道且不丧失捕食活性，原因即是其菌丝在老化过程中能产生大量厚壁孢子，这种孢子对外界环境具有较强的抵抗力，且能耐强酸而不易被家畜消化液及酶等物质所灭活，在应用实践上具有更广阔的前景，因此相关研究较多。研究显示，该菌对奥斯特线虫、盅口线虫、细颈线虫和圆线虫等多种寄生性线虫的都具有较高的捕食能力，且其捕食活性会随着幼虫数量的增加而提高，甚至能高达100%[8]。

此外，还有以Pochoniachlamydosporia等为代表的可作用于寄生性线虫虫卵的卵寄生性真菌，其气生菌丝会通过体细胞质浓缩、外壁增厚等过程形成厚壁孢子，并能顺利通过动物消化道，进而作用于动物寄生性线虫的虫卵和雌虫，如对肝片吸虫、犬弓首蛔虫、马副蛔虫及猪蛔虫等多种寄生虫虫卵均有明显的防控效果。现已有其商品化制剂应用于植物线虫防治，且防治效果较好。

2 捕食器形成机制的相关研究

捕食线虫性真菌是一个庞大而多样的真菌类群，在有线虫存在的情况下，它可从腐生型转变为捕食型，并通过捕食器、一系列溶解酶和其他毒力因子等共同将自由生活的线虫捕获和致死。在作用方式上，不同的真菌有着不同的诱捕装置，如黏性菌网、黏性菌结或黏性菌丝；在将线虫捕获后，真菌菌丝穿透线虫，分泌裂解酶，在线虫体内形成菌丝网络。除此之外，还有能形成收缩性菌环的真菌，它们一般是由3个从菌丝体侧上产生的环状菌丝连接而成，其环内表面十分敏感，若有线虫接触，便会迅速膨胀至原体积的3倍，将线虫牢牢捕获。这些捕食器的形成与相关作用机制不仅作为对抗线虫的武器，也是捕食线虫性真菌由腐生生活向捕食生活方式转变的重要标志。捕食线虫性真菌捕食器的产生数量与其相对活性密切相关，因此有关捕食器形成机制的研究已成为了当前捕食线虫性真菌的热点[9]，王文蕊等[10]在捕食线虫性真菌的捕食器的形成、进化、基因组、转录组和蛋白质组的研究中取得了明显进展，为捕食器形成及捕食机制的阐明提供了新的思路和重要信息。

乙醛酸循环是植物细胞内脂肪酸氧化分解后合成糖的过程。这一过程广泛存在于植物和微生物中。苹果酸合成酶是乙醛酸循环中的一种关键酶，对微生物病原菌的致病性是必不可少的。在昆虫病原真菌绿僵菌和白僵菌中发现乙醛酸循环与分生孢子的萌发有关,Zhao X Y等[11]对A.oligospora的AoMls基因进行敲除后发现，在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上经过处理的A.oligospora与未处理的真菌相比，生长速度和菌落形态无明显差异，但经过处理的A.oligospora捕食器的形成较缓慢，且只产生1个或2个未成熟的菌环，同时分生孢子的数量也显著减少，且不能利用脂肪酸和乙酸钠进行生长。此外，经过处理的A.oligospora杀线虫活性显著降低。这些均表明AoMls基因在A.oligospora的分生孢子的形成、捕获和致死线虫中起着重要作用。黏附因子是胞外纤维聚合物的主要组成部分，它大量存在于捕食线虫真菌的黏性菌环外表面，且与捕食器的进化过程相关，因此基于黏附因子相关基因的系统发育分析对于理解诱捕装置的进化具有重要意义。近年来，昆虫病原真菌绿僵菌细胞壁蛋白Mad1的同源基因AoMad1被认为参与了少孢节丛孢菌的黏附作用。Li J等[12]克隆了45株捕食线虫性真菌的Mad1同源基因，系统发育分析表明，形成非收缩性黏附菌环的物种基本上是由两个谱系演化而来的，显著的正选择压力可能作用于最早时期的真菌，产生了黏性菌环和收缩性菌环两类捕食线虫性真菌，表明Mad1基因可能在捕食线虫真菌的进化过程中起重要作用。Liang L等[13]对A.oligospora的AoMad1基因进行敲除，结果发现，AoMad1基因的缺失使得真菌对氮源更敏感，在线虫存在的情况下会产生更多捕食器。通过转录组分析，与未经处理的真菌相比，AoMad1基因敲除后的菌株有大量基因差异表达，其中许多基因与氮代谢、真菌-线虫相互作用和菌丝体发育有关。氮元素是构成生物的最主要元素之一，在动植物生命话动中起着重要作用。有研究指出，氮元素在捕食器的形成中具有重要作用，如脱落酸及硝酸盐能提高D.stenobrocha诱虫能力和捕食线虫能力，而外源一氧化氮则降低D.stenobrocha的诱虫能力。这也很好的解释了在利用商品化的捕食线虫性真菌对根结线虫防治中，防治效果可达到90%以上的原因，即根瘤菌的固氮对捕食线虫性真菌的捕食器形成起到了正向的促进作用。

在丝状真菌中，自噬参与了生长和发育过程，特别是其中的细胞分化过程,如生长发育、细胞凋亡及孢子形成等，自噬均起到了关键性作用。如对A.oligospora的自噬现象研究后证实，自噬现象产生于真菌被线虫诱导产生捕食器形成的早期阶段，但将A.oligospora中atg8基因敲除后，发现线虫诱导的自噬现象消失，而且捕食器的形成也受到抑制，从而降低了真菌对线虫的致病性。组学分析表明，在捕食器形成的早期，A.oligospora中参与氨基酸生物合成的基因表达上调，如GCN4的转录活性被诱导，说明线虫可通过触发真菌细胞内氨基酸饥饿来诱导真菌产生自噬现象。同时，AoRab-7A基因也参与了A.oligospora诱导的自噬过程。此外，在捕食器形成过程中，还观察到许多菌丝细胞融合或菌丝交接中具有细胞间信号传递机制。有丝分裂原激活蛋白激酶等在这种通讯中起着重要作用[14]。沃洛宁体(Woronin body)是在高等真菌种一种独特的细胞器。当菌丝损伤后，能迅速封闭穿孔隔膜，从而减少胞质的丢失，促进菌丝愈合。在许多真菌病原体中，沃洛宁体也被认为是其致病的重要因素。Liang L M等[15]对A.oligospora的AoHex1基因研究后发现，该基因是A.oligospora沃洛宁体的一个重要组成部分；将其敲除后，沃洛宁体丧失，同时真菌的生长速率、分生能力等均受到影响，捕食器也不再形成。此外，捕食线虫性真菌与细菌共享微生境，相互作用，但对这些细菌对其捕食器形成的影响则被严重低估，如有研究报道细菌的代谢物质可促进捕食器的形成[16]。

3 基因组学及相关捕食机制的研究

自捕食线虫性真菌被发现以来，许多学者已做了捕食特性、生化机制及临床应用等方面的大量研究工作。虽然基因组学及其相关捕食机制的相关研究起步较晚，但发展较为迅速，在分子水平上揭示了其基因组特征、起源、进化特点、致病能力及腐生能力等。

丝裂原活化蛋白激酶是一种相对保守的信号转导途径，能转导多种细胞外信号来调节生长和分化过程，它在控制真菌生长、发育和繁殖等方面起着重要的作用。目前，已由真菌中鉴定出了4种不同的MAP激酶基因，即Hog1、Slt2、Spm1和Fus3，其中的Slt2首先由模型真菌-酿酒酵母中被鉴定，发现它在维持细胞壁完整性的途径中起作用。近年来，Slt2在昆虫病原真菌中的作用也得到了研究。Zhen Z Y等[17]对A.oligospora和M.haptotylum中Slt2的同源基因AoSlt2和MhSlt2进行了功能鉴定，发现AoSlt2和MhSlt2的破坏可导致菌丝生长减少，对环境胁迫的敏感性增加，并且无法产生分生孢子和线虫诱捕结构；同时，产孢相关基因(AbaA、Sep2和MedA)和细胞壁合成相关基因(Chs、Glu和Gfpa)的转录下调，表明MAP激酶Slt2同源基因在两种捕食线虫性真菌的菌丝生长、分生、捕食器的形成和致病性中起着相似的作用。

有研究报道，当将细胞色素P450基因破坏后，A.oligospora的表型发生显著差异并产生了大量气生菌丝[18]，且有3个新的PKS-TPS环氧环己酮衍生物在菌丝周围大量积累，这些代谢产物具有明显的杀线虫活性。将聚酮合酶基因PKS敲除后，捕食器的数量与捕食活性上提高了10倍左右。转录谱分析表明，A.oligospora捕食器的形成与PKS信号通路有关，并受Zn(2)-C6型转录因子的调控。Yang X W等[19]报道将A.oligospora的AoRab-7基因敲除后，该菌不再产生捕食器，从而丧失了捕获线虫的能力。然而，将AoRab-2基因敲除后，仅仅对分生孢子的产量有轻微影响，而对其他特征性的表型无明显影响。此外，有研究证实甘油在线虫诱导A.oligospora的捕食器形成过程中大量积累，在敲除编码糖原磷酸化酶的gph1基因后，甘油含量下降，且捕食效率也随之降低，真菌的生长速度和分生能力也受到影响。捕食线虫性真菌能分泌丝氨酸蛋白酶、几丁质酶等多种胞外水解酶来消化和渗透线虫表皮和卵壳[20]，然而，对捕食线虫性真菌的这些几丁质酶的结构和功能知之甚少。有研究报道，A.oligospora中16个编码几丁质酶的基因开放阅读框，都属于糖苷水解酶家族18；当碳元素缺乏时，大部分几丁质酶的表达受到抑制，而缺氮元素时，所有几丁质酶均上调。此外，在几丁质底物存在的情况下，一些几丁质酶的基因表达上调，如AO-59、AO-190和AO-801。这些研究表明，捕食线虫性真菌的形态调控及代谢产物的生物合成是通过某些基因表达来改变的，这些发现将为未来真菌生防制剂的研制提供了新的途径。Ji X L等[21]基于基因组学、蛋白质组学和qPCR数据建立了A.oligospora捕食器的形成模型。在该模型中，多个真菌信号转导途径被其线虫诱导激活，以进一步调节与多种细胞过程相关的下游基因，如能量代谢、细胞壁和黏附蛋白的生物合成、细胞分裂、甘油积累和过氧化物酶的产生。也有报道通过对M.haptotylum与A.oligospora基因组的比较，发现蛋白质结构域家族的扩展和物种特异性基因的大量存在，这在捕食线虫真菌的进化中起着重要作用，对这些真菌对寄生生活的适应具有重要意义，而差异基因、同源基因、罕见的转座子和重复诱导的点突变机制等在真菌腐生起源、双重生存策略的转变、致病性相关基因的鉴定、线虫与真菌相互作用共进化，感染机制等方面发挥了巨大的作用。

4 捕食相关活性物质的研究

捕食线虫性真菌通过机械性或黏附作用将线虫捕获后，再分泌相关酶类等物质将线虫致死并消化[22]，但现在对于这些特异性或非特异性物质的种类还不是十分清楚。因此，有关这些物质的研究将是未来利用捕食线虫性真菌进行生物防治中一个很重要的部分，对其进行分离纯化后直接用于生物防治将是未来一个很重要的研究方向。

Wei L X等[23]对A.oligospora中倍半萜烯环氧环己烯酸(SEC)寡孢菌素A进行了X射线衍射分析，这是首次完全确定自然产生的代谢物的相对构型，证实该物质具有独特的抗虫活性。随后又有人纯化了A.oligospora中的3个新的寡孢菌素B、D(6、11)及其2个衍生物，并发现当线虫死亡时，真菌能在6 h内迅速降低寡孢菌素B和D(11)的浓度，这与线虫存活时的情况相反。寡孢菌素D(11)为真菌菌落生长和真菌与线虫相互作用的特异性代谢信号[24]。寡孢菌素与真菌的腐生和致病能力密切相关。Zhao H L等[25]表达了A.oligospora胞外丝氨酸蛋白酶P186基因，用P186重组蛋白对秀丽隐杆线虫和捻转血矛线虫分别作用12、24、36 h后，对秀丽隐杆线虫的杀灭率分别为62%、88%、100%，对捻转血矛线虫的杀灭率为52%、65%、84%，表明其具有较强的线虫毒性。另有报道从A.entomopaga中分离出了6种微量代谢物，这些物质具有促进黏性菌结形成的作用，并表现出较强的线虫吸引能力。这些新调节代谢产物的发现表明捕食线虫性真菌可能在不断进化过程中会提高对猎物的反应。

在生物体内，酶发挥着非常广泛的功能。信号转导和细胞活动的调控都离不开酶，特别是激酶和磷酸酶的参与，现在已知多数酸性磷酸酶对线虫有作用，如A.sinensis液体培养基中的蛋白水解酶及D.flagrans的粗酶提取液对血管圆线虫具有较高的活性作用。随着对这些活性物质的认识和深入挖掘，根据这些活性物质作用寄生性线虫的特点，直接将其应用于生防实践中将有利于捕食性真菌的应用推广。

5 捕食性真菌应用模式的研究

在自然环境中，只有极少量的捕食线虫性真菌能与粪便中的幼虫接触并发挥作用。因此，在捕食线虫性真菌的临床应用上，需人为的通过一定措施来提高环境中的真菌数量。要达成这一目标，最初是将培养好的真菌及培养物粉碎后撒布于草场上，后来又采用直接将真菌大量混合在动物粪便中的方法，但这两种方法无论从人力还是物力的角度来看，都达不到理想的效果。1993年，Gronvold发现了几种可以产生厚垣孢子的捕食线虫性真菌，这些孢子可以顺利通过动物消化道，进而在粪便中萌发并将由虫卵发育而来的幼虫捕获，具有广阔的开发应用前景。随着研究的深入，还发现在捕食线虫性真菌培养的过程中加入某些化合物可以提升或抑制真菌的产孢量[26]，线虫中的某些物质也能提高捕食器的数量，或用低能离子束诱导突变，这些措施可促使真菌产生更多的胞外蛋白酶并取得了很好的效果。如何将这些成果转化到实践应用中，合适的制剂剂型和应用模式非常关键，因此有关捕食性真菌制剂和临床应用模式的研究是当前急需解决的问题。

在较长的一段时间内，捕食线虫性真菌的制剂均为孢子悬浮液，在运输过程中很容易造成污染及生物活性的降低，从而导致菌株捕食能力的下降，影响了捕食性真菌在临床应用的效率。为了避免这些不足，Alexandre O T等[27]将D.flagrans与M.thaumasium混合制成以海藻酸钠为壁材的微丸，可以提高真菌通过动物消化道的能力，对马圆线虫的L3数量减少率超过80%。VieiraS等[28]将前述两种捕食线虫性真菌与卵寄生性真菌混合培养，两类真菌的补充和结合具有更高的防治效率。2006年，国内内蒙古农业大学的杨晓野教授和王瑞教授团队首次运用真空冷冻干燥技术将捕食性真菌做成冻干生物制剂，可将捕食性真菌的保存时间延长至数十年，而且冻干制品具有疏松多孔结构，溶水和复水性极好，方便携带；在防效上，对线虫的捕食率可达95.8%，为基层临床的使用提供了便利[29]。2017年，该团队又首次提出了将驱虫药物与捕食性真菌联合应用的方法[30]，前者作用于线虫成虫，而后者作用于药物驱虫后所排虫卵或由虫卵发育而来的线虫幼虫，两者相互补充，既预防了线虫的传播和感染，又可以减少化学药物的大量使用，从而推迟和避免了寄生虫耐药性的产生及减少了化学药物的使用和对环境的污染，可以达到更理想的寄生虫防控效果。后来Sagüés M F等[31]将D.flagrans加入大豆蛋白基聚合物设备(controlled release device，CRD)中制成了一种控释剂。测定了CRD中真菌的释放速率和CRD在空心绵羊瘤胃中的停留时间。给羊投喂后，每隔一个多月每周提取一次CRD，观察其物理结构，并收集粪便，并观察真菌在培养皿中的捕食活性。结果发现，CRD在瘤胃中缓慢降解超过4周，并将D.flagrans释放到粪便中且大豆蛋白基聚合物的配方不影响真菌的捕食活性。此外，很多年前就知道氧化铜颗粒或某些植物化合物(如单宁酸)等都对线虫有着或多或少的驱虫作用，如果可以将这些物质与捕食线虫性真菌联合应用，不仅可以提高对线虫的防治效果，还可解决某些地区畜禽的营养缺乏症及提高产品品质。在捕食性真菌的临床应用中，多年来，学者们都认为捕食线虫性真菌对环境没有危害，十分安全。但近几年也有相关报道称，捕食线虫性真菌会对轮虫(废水生物处理中能够改善污水质量的生物体)的数量和密度造成一定影响[32]，捕食线虫性真菌的大量出现可危及轮虫种群，因此有必要对捕食线虫性真菌在其他环境中对某些生物的影响做详细研究。综合来看，这些负面影响是有限的，即其产生的影响与人类通过生物防治所获得的总体效益相比是微不足道的。

6 展望

在线虫防治方面，即使是化学药物缓释剂、长效制剂等最新的给药技术，也无法避免越来越严重的耐药性问题，而生物防治是未来非常具有应用潜力的一种寄生虫防治措施。但目前捕食线虫性真菌还停留在实验室阶段而未能推广应用，还有一系列问题亟待解决，如大规模的培养问题、合适制剂的制备、从培养到制剂制备的工艺；其次，在生防治剂方面，还没有相关标准，也需要科研人员来建立。再就是，随着捕食线虫性真菌基础研究的不断完善，寻找相关具有杀线虫的真菌活性物质或关键物质，将会极大地促进捕食性真菌的实践应用。此外，还应加强真菌制剂的成本控制和产业化的推广，为捕食线虫性真菌商品化应用奠定基础。