新疆部分地区牛梨形虫和无浆体感染情况调查分析

陈宋琴，李才善，葛晓敏，韦丽婷，刘一凡，祖利亚·克力木江，马 英，郭庆勇

(新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052)

牛梨形虫及牛无浆体均属于蜱传病原(tick-borne pathogen)，通过硬蜱叮咬宿主方式进行传播[1]。家畜感染这些病原所引起的疾病会表现出一系列的临床症状，致使其生产力降低，给牧民带来巨大的经济巨大损失。新疆地区感染牛的主要蜱传病原为环形泰勒虫(Theileriaannulata)、双芽巴贝斯虫(Babesiabigemina)及牛无浆体(Anaplasmabovis)[2]。环形泰勒虫(T.annulata)引起的疾病主要临床特征为高热、贫血、消瘦和周身淋巴结肿胀，并引起致死性白细胞增殖紊乱[3]。感染双芽巴贝斯虫(B.bigemina)的家畜临床症状表现为高热、贫血、血红蛋白尿甚至死亡[4]。牛无浆体(A.bovis)属于立克次体目、无浆体科和无浆体属，是一类经蜱传播的胞内寄生菌，主要寄生于哺乳动物的血细胞中，牛、羊和鹿中最常见[5]。其引起疾病的临床症状以体温升高、体重降低、虚弱无力、黏膜苍白、淋巴结炎甚至死亡为主要特征。

新疆吐鲁番和阿勒泰等地区畜牧养殖主要以放牧形式为主[6]，家畜很容易被蜱虫叮咬而被感染蜱传病原。因此，本试验以吐鲁番和阿勒泰地区为试验点，以牛为研究对象，对牛环形泰勒虫(T.annulata)、牛双芽巴贝斯虫(B.bigemina)和牛无浆体(A.bovis)进行PCR检测并分别基于Tams1基因、Rap1α基因、16S rRNA基因构建系统树进行进化分析。通过对3种病原及其混合感染情况进行调查，为该地区掌握3种病原的感染状况及为防治提供数据支持，以助于提出该地区科学、合理的防治措施，以期减少此类病原为牧民带来的经济损失。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集 2018年7月至2019年6月共采集120份牛血液样品,其中阿勒泰地区70份、吐鲁番地区50份。通过颈静脉采血方法，采集1.5岁以上牛的全血，将其分装入含有EDTA的抗凝管中，置于4℃环境中，将血液样品装入冰盒中转运到新疆农业大学动物医学学院寄生虫实验室。

1.1.2 主要试剂 血液DNA提取试剂盒、2×EcoTaqPCR Super Mix ，天根试剂公司产品；胶回收试剂盒、质粒DNA提取试剂盒，美国Axygen 公司产品；PEASY-T1 载体，北京全式金生物技术有限公司产品；DH5α感受态细胞，Takara公司产品；引物探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.1.3 主要仪器设备 PEASY-T1载体，北京全式金生物技术有限公司产品；DH5α感受态细胞，Takara公司产品；RADIAL20型台式高速离心机，西班牙ORTO ALRESA公司产品；PCR仪、Gel Doc2000紫外凝胶成像系统，美国Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 牛全血DNA提取 按照天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书提取牛血DNA,置于-20℃保存。

1.2.2 3种蜱传病原检测 利用PCR技术对牛环形泰勒虫、牛双芽巴贝斯虫及牛无浆体病原进行检测。利用DNA Man及Premier 5.0软件设计1对牛环形泰勒虫特异性引物,并参考TERKAWI[7]设计的牛双芽巴贝斯虫和REYE[8]设计的牛无浆体的特异性引物。PCR反应退火温度根据其引物片段中的GC含量来计算，引物见表1。

以提取牛全血基因组DNA为模板，PCR反应体系为50 μL，2×EcoTaqPCR Super Mix 所加体系为25 μL，上游和下游引物各加2 μL，模板DNA加入2 μL，最后双蒸水至50 μL。

PCR反应条件：95℃ 5 min；94℃ 30 s，退火温度根据表1设定，退火时间为30 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min。PCR结束后，取5 μL扩增产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，20 min 后观察电泳结果。

表1 检测3种蜱传病原所使用的引物序列

1.2.3 测序和系统发育分析 按照北京全式金生物技术有限公司pEASY-T1 Cloning Kit说明书，将回收的目的片段3 μL与1 μL pEASY-T1 载体连接,导入到50 μL 大肠埃希氏菌DH5α 感受态细胞中，并涂板筛选阳性菌株，获得重组质粒，将挑选好的菌株进行培养，按照美国Axygen公司的质粒DNA小量提取试剂盒说明书进行质粒提取。以提取的重组质粒为模板进行PCR鉴定，挑选PCR鉴定为阳性的重组质粒送往上海生物工程技术服务有限公司进行测序。

测定的基因序列先在DNA Man上进行比对，再在NCBI网站上经BLAST进行同源性比对。并从GenBank上获得其他已报道的3种蜱传病原相关基因序列。运用MEGA 6.0软件中ML方法，以T92+G+I模型分别分析计算这3种病原的种间遗传距离。牛环形泰勒虫(T.annulata)、牛双芽巴贝斯虫(B.bigemina)和牛无浆体(A.bovis)分别选用牛巴贝斯虫(Babesiabovis)、吉氏巴贝斯虫(Babesiagibsoni)和牛环形泰勒虫(T.annulata)为外立群。

2 结果

2.1 3种病原PCR检测结果

根据表1所示引物序列，牛环形泰勒虫、牛双芽巴贝斯虫及牛无浆体经PCR扩增后，分别在琼脂糖凝胶电泳上出现了768、412、551 bp大小目的片段，其电泳结果分别如图1、图2和图3所示。

M.DNA标准DL 2 000; 1～7.检测样品；8.阴性对照M.DNA Marker DL 2 000;1-7.Test samples;8.Negative control

M.DNA标准DL 2 000; 1～9.检测样品；10.阴性对照M.DNA Marker DL 2 000;1-9.Test samples;10.Negative control

2.2 3种病原的感染情况

各个地区病原感染情况见图4。在120份牛血样品中，利用PCR与套式PCR方法进行病原学检测，发现58头牛感染了1种～3种病原，3种病原检测调查情况见表2。由表2可知，牛环形泰勒虫的感染率最高为20.8%(25/120)，阿勒泰地区的感染率21.1%(15/70)比吐鲁番地区20.0%(10/50)感染率高。其次是牛双芽巴贝斯虫14.2%(17/120)，吐鲁番地区的感染率24.0%(12/50)是阿勒泰地区7.1%(5/120)的1倍。牛无浆体感染率最低11.7%(14/120)，且阿勒泰地区11.4%(8/120)与吐鲁番地区12.0%(6/120)的感染率相同。运用SPSS软件中的单因素分析方法，对两地区感染情况进行差异显著性分析，P>0.05,表示两地区的3种病原感染率差异不显著。

表2 3种病原检测调查情况

M.DNA标准DL 2 000; 1～9.检测样品；10.阴性对照M.DNA Marker DL 2 000;1-9.Test samples;10.Negative control

图4 3种病原检测结果Fig.4 Detection results of three pathogens

2.3 3种病原混合感染情况

在感染的56份牛血样品中，有28头牛感染2种～3种病原(感染2种病原23份，感染3种病原5份)，最常见的混合感染性病原是牛环形泰勒虫和牛双芽巴贝斯虫(9/56)，其余2种混合感染情况相同(7/56),3种病原混合感染情况出现5例(表3)。

表3 3种病原混合感染情况调查

2.4 遗传进化分析

经测序得到的吐鲁番地区与阿勒泰地区3种病原序列分别在NCBI上进行同源性比对并构建系统发育树，其比对结果分别为环形泰勒虫、牛双芽巴贝斯虫与牛无浆体系统发育树(图5、图6和图7)。

系统发育表明阿勒泰地区牛环形泰勒虫与突尼斯株(登录号：AF214870.1)形成了一簇，而吐鲁番地区的环形泰勒虫单独一簇。两个地区的牛双芽巴贝斯虫与印度尼西亚株(登录号：KY484520.1)和泰国株(登录号：AB594816.1)属于同一簇。牛无浆体与伊朗(登录号：KP017262)在同一分支上。

3 讨论

新疆作为全国畜牧养殖大区，牛、羊养殖业是主要的畜牧业之一，根据之前相关文献报道[9]，有不少地区牛感染过环形泰勒虫、双芽巴贝斯虫及牛无浆体，并给当地养殖业带来巨大的经济损失[10]。

▲为牛环形泰勒虫Tams1基因序列▲The Tams1 gene sequence of T.annulata was determined in this paper

▲为牛无浆体16S rRNA基因序列▲ means the 16S rRNA sequence of A.bovis was determined in this paper

通过PCR和套式PCR对牛环形泰勒虫、牛双芽巴贝斯虫和牛无浆体检测。结果发现，吐鲁番地区的3种蜱传病原总体感染率56.0%(28/50)高于阿勒泰地区40%(40/70)，这可能是由于吐鲁番地区存在更加丰富的媒介蜱虫种类。于心[11]对新疆地区分布的蜱虫进行调查，在天山山地发现的蜱种类是阿勒泰地区的6倍，吐鲁番市位于天山山地东部，因此，其家畜感染蜱传病原的机率就会更高。并且两个地区都是牛环形泰勒虫的感染率最高，说明璃眼蜱可能是当地优势媒介蜱之一。海尼木古力·艾合买提[12]对吐鲁番市托克逊县进行媒介蜱的鉴定，从所采的547只蜱中共检测到517只都是残缘璃眼蜱，刘继荣等[13]对阿勒区硬蜱区系研究中发现，璃眼蜱属占总蜱数的40%。因此，当地的环形泰勒虫和牛无浆体的感染率都较高。

本调查观察到有28头牛感染2种～3种病原(感染2种病原23份、感染3种病原5份)，混合感染率最高的是牛环形泰勒虫和牛双芽巴贝斯虫，牛环形泰勒虫几乎与其他所有病原都出现混合感染，说明牛环形泰勒虫是最有可能出现混合感染的潜在病原。在新疆，牛通常与马、绵羊和山羊一起放牧，混合放牧条件使蜱虫更容易在动物之间爬行传播病原，从而使家畜增加混合感染的可能性。根据文献记录，残缘璃眼蜱[14-15]既可以传播环形泰勒虫也可以传播牛无浆体，这种携带多种病原的媒介蜱也是使家畜出现混合感染的原因之一。Li Y C等[16]对新疆牛双芽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫、牛无浆体及立克次体混合感染进行调查发现，这4种病原都会存在混合感染的情况，因此，试验点可能还会出现其他混合感染的潜在病原。根据调查发现，感染多种病原的牛可能比感染一种病原的牛有更明显的临床症状，其症状表现复杂且有可能导致病情加重[10]。

调查中利用PCR方法扩增出的牛环形泰勒虫、牛双芽巴贝斯虫及牛无浆体序列经NCBI上的Blast进行比对的结果分别为95%～98%、99%～100%、96%～99%，说明所扩增的片段都存在高度的保守性。根据这些基因所构建的系统进化树发现，本试验获得的牛环形泰勒虫株与突尼斯虫株，牛双芽巴贝斯虫与泰国株和印度尼西亚株，牛无浆体与伊朗株在同一分支上，都表现为较近的亲缘关系。

调查结果表明，牛环形泰勒虫、牛双芽巴贝斯虫和牛无浆体在新疆阿勒泰和吐鲁番两个地区均有感染的情况，且同一头牛还会感染2种～3种病原。此次研究对吐鲁番和阿勒泰地区这3种病原及其混合感染进行调查，从而为这两个地区蜱传病原的分布提本数据支撑，增强当地牧民对相关疾病的预防，媒介蜱的驱除及病原的检测，减少当地牧民经济损失。