西宁地区宠物犬源肺炎克雷伯菌血清型鉴定、致病性及耐药性检测

解秀梅，童富珍

(1.青海畜牧兽医职业技术学院，青海湟源 812100；2.佰汇缘宠物医院，青海西宁 810001)

肺炎克雷伯菌属于肠杆科中克雷伯菌属一种革兰氏阴性菌，根据生化特性可以分为肺炎亚种、鼻炎亚种和鼻硬结亚种，其中肺炎克雷伯菌亚种生存能力强，肺炎克雷伯菌广泛分布于自然界中，主要存在于动物及人的消化道、呼吸道、泌尿生殖道等[1-2]。肺炎克雷伯菌是人畜共患的条件性致病菌，可以引起人及多种动物呼吸道、尿道感染和败血症等。近年来，关于动物感染肺炎克雷伯菌的报道逐渐增多，且出现了高致病性、高水平多重耐药肺炎克雷伯菌菌株，给养殖业造成严重的经济损失，同时威胁公共卫生安全及人类健康[3-4]。当宠物犬感染肺炎克雷伯菌后，出现严重呼吸症状，尤其肺部的感染，严重的可以导致死亡[5]。人兽共患传染病依旧是学者们的研究热点，宠物犬作为人们的主要伴侣动物，人兽共患细菌病可能对人存在一定潜在威胁，应该引起注意[6]。

本研究从西宁地区宠物医院采集患有呼吸道疾病宠物犬的咽拭子、鼻拭子和痰液等病料进行肺炎克雷伯菌鉴定，并对其致病性、血清型及耐药性进行检测，旨在为宠物犬肺炎克雷伯菌病防控及临床指导用药提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 2019年1月至2020年6月，从西宁地区宠物医院采集患有呼吸道疾病宠物犬的咽拭子、鼻拭子及痰液等样本127份。

1.1.2 实验动物 22 g～25 g昆明系小鼠，由青海畜牧兽医职业技术学院试验动物饲养中心提供。

1.1.3 主要试剂 普通营养肉汤、麦康凯肌醇阿东醇羧苄青霉素琼脂(MIAC)、普通营养琼脂平板，北京奥博星生物技术有限责任公司产品；药敏纸片，广东环凯生物有限公司产品；阴性菌生化鉴定试条，威正翔禹生物科技有限公司产品；DNA Marker DL 2 000、2×TaqMarker Mix，康为世纪科技有限公司产品。

1.1.4 主要仪器设备 多功能PCR仪，英国Techne公司产品；凝胶成像系统，美国Bio-Rad产品；电泳仪，北京六一生物科技有限公司产品；恒温培养箱，上海一恒科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离培养 采集患有呼吸道疾病宠物犬的咽拭子、鼻拭子和痰液等样本，样本经过处理后，接种于普通营养肉汤中增菌培养，37℃振荡培养12 h～18 h后，接种于MIAC平板上，37℃培养12 h～18 h，挑MIAC平板的单个菌落接种于营养肉汤中进行纯化培养后，进行染色镜检显微镜观察其形态学。

1.2.2 细菌生化试验 取出纯化培养的分离菌株接种于阴性菌生化鉴定条中，37℃培养12 h～24 h，按照阴性菌生化鉴定试条说明书进行生化鉴定。

1.2.3 细菌的PCR鉴定 参照文献[6]，根据GenBank中登录的肺炎克雷伯菌khe基因序列 (CP035202.1)设计特异性鉴定引物P1:5′-ATGAAACGACCTGATTGCATTCGC-3′，P2:5′-TTACTTTTTCCGCGGCTTACCGTC-3′，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。用基因组DNA试剂盒提取分离菌株的DNA，用特异性引物进行PCR检测， 其PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行基因测序，其测序结果与GenBank中登录序列用用BLAST软件进行同源性比对。同源性百分比≥99%，可以定义到种的水平；若同源性在97%～98.9%，可以定义到属的水平；若<97%，则定义为科水平。

1.2.4 动物攻毒试验 参照文献[7-8]报道的方法， 将分离菌株培养至对数期计数，每株分离菌株每株分离菌株腹腔注射0.2 mL(108CFU/mL)，对照组注射等量的无菌的PBS，攻毒12 h后，观察小鼠发病情况，试验期为7 d。对死亡的小鼠进行细菌分离鉴定。

1.2.5 细菌血清学鉴定 参考文献[9-10]，设计肺炎克雷伯菌荚膜血清型(K1、K2、K3、K5、K20、K54和K57)引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(表1)，用PCR方法对肺炎克雷伯菌进行荚膜血清型检测。

表1 荚膜血清型分型引物序列

1.2.6 药敏试验 参照美国美国临床实验室标准化协会(CLSI)2019推荐的标准K-B纸片法进行结果判断，将分离菌株调整为0.5个麦氏浊度，均匀涂布在普通营养平板生，贴上药敏纸片，取平均值，分析其耐药性。

2 结果

2.1 细菌分离培养结果

采集的病料组织在肺炎克雷伯菌鉴别培养基MIAC上长出了大小一致、边缘整齐、半透明的桃红色菌落，长时间培养菌落拉动成丝(图1)；在普通的营养养基上长出扁平的、圆形的、半透明菌落；通过革兰氏染色，显微镜观察其形态学，分离菌株在镜下呈现为革兰氏阴性的两端钝圆粗短杆菌状(图2)。

图1 分离菌株菌落形态

图2 分离菌株革兰氏染色镜检形态(1 000×)

2.2 生化鉴定结果

分离菌通过生化鉴定结果显示，鸟氨酸脱羧酶、接触酶、尿素酶、L-阿拉伯醇、精氨酸双水解酶均为阴性；甲基红试验、V-P试验均呈阳性；不发酵D-麦芽糖、D-葡萄糖、D-纤维二糖、D-海藻糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇、D-山梨醇、L-鼠李糖等。其生化鉴定与肺炎克雷伯菌基本上一致，经过统计，74株分离菌株初步鉴定为肺炎克雷伯菌。

2.3 PCR鉴定结果

将初步鉴定为肺炎克雷伯菌用PCR方法进行进一步鉴定，以上提取的分离菌株的基因组DNA为模板，用肺炎克雷伯菌khe基因特异性鉴定引物鉴定。结果显示，初步鉴定为肺炎克雷伯菌的均扩增出大约为489 bp的目的条带(图3)。测序结果显示，74株肺炎克雷伯菌与GenBank中登录肺炎克雷伯菌同源性均≥98.0%。

2.4 致病性检测结果

昆明系小鼠在攻毒后的2 d～5 d，出现精神沉郁、采食量减少、呼吸困难，个别的小鼠出现急性死亡，剖检死亡的小鼠肺部出现严重出血、出血、水肿；肝、脾出现不同程度的出血，且从死亡小鼠的肺部、肝脏中分离得到的肺炎克雷伯菌。未攻毒组的小鼠健康存活。62株肺炎克雷伯菌具有致病性。

M.DNA标准DL 2 000；1～4.分离菌株；5.空白对照M.DNA Marker DL 2 000;1-4.Isolated strains; 5.Blank control

2.5 血清型鉴定结果

用PCR法对62株致病性肺炎克雷伯菌进行血清型(K1、K2、K3、K5、K20、K54、K57)检测，结果显示，K1血清型有18株(29.0%)、K2血清型有2株(3.2%)、K5血清型有23株(37.1%)，K20血清型有12株(19.4%)、K54血清型3株(4.8%)，未检测出血清型有 4株(6.5%)。62株致病性肺炎克雷伯菌以K5、K1血清型为主要流行的血清型。

2.6 耐药性分析结果

用K-B药敏纸片法对62株致病性肺炎克雷伯菌进行药敏试验检测，分析其耐药性。结果由表2可知，62株致病性肺炎克雷伯菌对阿莫西林、氨苄西林、庆大霉素、新霉素、氟苯尼考、强力霉素、大观霉素、磺胺二甲氧嘧啶8种药物耐药性较高，耐药率在61.3%～100%之间；对头孢噻呋、头孢曲松、头孢喹肟、左氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、林可霉素、磷霉素8种药物耐药率在9.7%～35.5%之间。

表2 分离菌株的耐药性结果

3 讨论

肺炎克雷伯菌最早是由Friedlander在大叶性肺炎患者的痰液中分离鉴定到，是医院中获得性肺炎的常见致病菌之一，尤其是泛耐药肺炎克雷伯菌严重危害着ICU患者生命安全，成为临床常见的主要致病性病原菌，严重威胁人们的健康[4-5]。肺炎克雷伯菌是重要的人畜共患条件病原菌，当动物机体抵抗力低下时，该菌在体内适合的环境中大量繁殖并致病，发生其内源性感染，引起严重的呼吸系统症状和败血症等，尤其对幼龄动物其感染率和致死率均较高[11]。本研究从青海西宁地区采集的127份的患呼吸道症状的宠物犬样品中分离得到62株致病性肺炎克雷伯菌，并用动物试验证明其致病性，说明该菌对宠物犬的危害较大，可能由于宠物患有犬瘟热、冠状病毒等病毒性疾病可以继发肺炎克雷伯菌感染，引起呼吸道感染，当宠物犬抵抗力下降时也会引起该病发生，因此，在宠物犬养殖过程中应该引起重视，加强其宠物饲养管理。肺炎克雷伯菌含有多种血清型，常见以K抗原血清型为主，临床中人和动物的肺炎克雷伯菌主要为K1和K2较常见，也存在其他血清型[8-10]。本研究结果表明，分离的62株致病性肺炎克雷伯菌有4种血清型，以K5(37.1%)和K1(19.4%)血清型为主要流行的血清型。与张文举等、杨延等报道有差异性，可能与地区有关，也与感染的宿主(狐狸、猪)等有关。

国内相关研究表明，肺炎克雷伯菌对临床中常用的药物产生很强的耐药性，并表现多重耐药性，个别菌株β内酰胺类和碳青霉烯类抗生素也产生耐药性，给该病治疗带来了很大的困难[12]。任君等[5]报道了天津市某动物医院犬子宫蓄脓脓汁分离的肺炎克雷伯菌对氨苄西林、头孢噻吩、麦迪霉素、哌拉西林耐药。张聪等[6]报道了从南宁地区宠物医院分离的伴侣动物源肺炎克雷伯菌对临床常用药氨苄西林、哌拉西林、头孢呋辛、四环素、多西环素、呋喃妥因、复方新诺明产生耐药性。本研究结果表明，肺炎克雷伯菌对临床中常用药物产生很强耐药性。在临床中治疗该病时应该选择敏感药物进行治疗，交替使用抗菌药物，提高治疗效果，降低其耐药率的增长。