“益气调血、扶本培元”药线灸对MID大鼠海马M受体、CREB含量的影响及其相关性

罗本华 曾启峰 吴小玲 李玉秋 王燕

(广西中医药大学，广西 南宁 530001)

血管性痴呆(VD)是临床可防治的痴呆类型，也可能是中国老年期痴呆的首发原因〔1〕；针灸防治VD是临床广泛共识，具有有效无毒、安全可靠的优点〔2〕。近年来，“益气调血，扶本培元”药线灸为防治VD新方法，具备了(生命)三焦气化与痴呆间的“相关论”〔3〕、“发病观”〔4〕、病机观〔5〕及“论治观”〔6〕等中医理论支撑，也取得临床改善VD学习、记忆障碍核心症状〔7，8〕的有效性和全面改善多发梗死性痴呆模型(MID)大鼠的认知障碍功能〔9〕的神经行为学等基础证据；概括其特点是：恢复三焦气化，促使精气神正常互化，恢复痴呆脑神功能；疏通三焦通道，畅达三焦气机，三焦上通下达使内生水湿痰毒瘀血排有去路，改善脑神功能的脑微环境，以利脑神功能显达；故该药线灸法是针对VD基础病理和基础辨病病机的干预方法。在前期该药线灸法改善MID模型大鼠中枢乙酰胆碱(ACh)障碍机制〔10，11〕的实验基础上，本实验初探了该药线灸对乙酰胆碱受体(AChR)作用和其胞内细胞信号转导的影响。

1 材料与方法

1.1动物与试剂

1.1.1实验动物 健康SPF级Wistar雄性大鼠70只，体重(280±20)g，由广西医科大学动物实验中心提供；室内温度18～22℃，相对湿度45%，室内采光按照白昼循环模式，标准粒饲料定时喂养，自由饮水，适应性喂养15 d。

1.1.2试剂及药物 大鼠毒蕈碱型AChR(M受体)、大鼠毒蕈碱型AChRM1(M1受体)、大鼠毒蕈碱型AChRM2(M2受体)ELISA KiT 96T(武汉基因美生物科技有限公司)；大鼠环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)酶联免疫检测试剂盒96T(上海联硕生物)；盐酸多奈哌齐(国药准字H20050978，卫材药业，5 mg/片，配成浓度10%的药液使用)；水合氯醛AR250G；2号壮医药线(直径0.5 mm，由广西中医药大学壮医药学院提供)。

1.1.3主要仪器 单道可调整支消毒移液器(10、200、1 000 μl)，酶标仪(LabsystemsMultiskan)，洗板机(ThermoLabsystems)，TGL-16M高速冷冻离心机，HH.CP-01W隔水式恒温培养箱，12号弯锡灌胃针(GWL-12W)，Morris水迷宫(中国医学科学院药物研究所)，PR0200电动玻璃匀浆仪。

1.2MID造模方法

1.2.1动物分组 70只大鼠采用随机数字表法随机分至预用栓子造模组60只和正常组10只；经Morris水迷宫，栓子造模组筛选出痴呆鼠40只，随机分至模型组、药线灸组、药物组和药线非穴组，各组10只。

1.2.2MID大鼠造模方法〔4〕采取同种大鼠股动脉血，在无菌条件下置37℃保温箱内，自然干燥24 h，经100目筛子过筛，制备小于200 μm的备用血凝块。临用时，按每10 mg血栓加0.3 ml生理盐水制成混悬液。按35 mg/100 g体重，3.5%水合氯醛腹腔麻醉大鼠。颈正中切开皮肤(约1 cm)，剥离胸骨舌骨肌、肩胛舌骨肌与胸骨乳突肌，暴露颈外动脉，分离颈外动脉上两分支，避开两分支，分别在颈外动脉上备2根手术缝合线，近心端先套一活结，结扎远心端。用儿科4号头皮针针头逆行穿刺右颈外动脉至右颈内动脉起始处，再用1 ml注射器缓慢注入0.3 ml栓子盐水悬液，60～90 s内注尽，使栓子经颈内动脉进入颅内至大脑各动脉，造成多灶性脑梗死，再结扎颈外动脉，缝合皮肤。将庆大霉素滴注切口处防感染。正常组手术方法与模型鼠制作一样，但只注射0.3 ml生理盐水。

1.3模型成功判定标准 栓子造模组于造模后7 d进行连续5 d的Morris水迷宫隐蔽平台试验训练，1次/d。以正常组第5天的平均逃避潜伏期为参考值，计算栓子造模组第5天的平均逃避潜伏期与参考值之差值与该鼠平均逃避潜伏期的比值，该值>20%定为痴呆鼠。本课题只用筛选过的痴呆鼠作为MID模型。Morris水迷宫实验方法与操作参考文献进行〔12〕。

1.4干预治疗

1.4.1药物治疗 药物组于造模并痴呆筛选后将1 mg/(kg·d)盐酸多奈哌齐溶于2 ml生理盐水中灌胃，于每日早晨8∶00灌胃。

1.4.2药线灸组治疗 按“益气调血、扶本培源”治则并采用针刺方法的组穴，取中脘、膻中、气海及血海双、足三里双(华兴邦动物穴位图谱)。药线灸操作方法：按《壮医药线灸疗法》采用2号药线(直径0.5 mm)，采用轻刺激手法和“先上后下、先躯干再四肢、先阳后阴”顺序，点灸以上腧穴各1壮。

1.4.3药线非穴组药线灸方法 选用双侧肋下两个固定非穴点，针刺双侧肋下各两个固定非穴点〔13〕，约相当于乳正中线外开2.5 mm肋弓下1 mm平行肋弓方向向外下斜刺3 mm；作为对照刺激点，轻刺激手法药线灸左3右4壮，或左4右3壮，交替。

1.4.4模型组与正常组治疗 两组均给予药线灸组相同时间、相同程度的捉抓刺激。

1.4.5疗程 5组均于模型筛选后，采用相应方法干预治疗，1次/d，6次/w，治疗4 w。

1.5观察方法

1.5.1海马组织取材方法 于干预方案结束后的次日早晨8∶00，断头处死实验大鼠，开颅迅速取出全脑组织，冰上操作，干净分离海马组织，即用冰冷生理盐水冲洗血液，电子天平称重后，迅速置于-80℃冰箱冻存，待相关检测。

1.5.2总M受体、M1受体、M2受体与CREB含量测定 标本融化后保持6℃的温度备用，按0.1 g加0.9 ml磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.4)比例稀释，冰上用超声匀浆器充分匀浆标本；3 000 r/min离心5 min；收集上清液，分装待检。按照各试剂盒步骤，应用双抗体夹心法检测M1受体、M2受体、总M受体与CREB的样本含量。各项检测均设立标准品孔、空白对照孔和样品孔；标准品孔均加50 μl不同浓度的标准品；样品孔先加10 μl待测样本，再加40 μl样本稀释液；样本孔和标准品孔每孔加入10 μl辣根酶标记抗体，置于37℃水浴锅中温育60 min，反复洗板5次，吸水纸拍干。各孔均加入底物A、B各50 μl，避光条件下37℃孵育15 min；加入50 μl终止液。用450 nm波长，测定各孔的吸光度(OD值)。根据标准品吸光度及标准品浓度，计算各样品的M1受体、M2受体、总M受体及CREB的含量。

1.6统计学方法 应用SPSS16.0统计软件进行单因素方差分析、LSD-t检验、DunnettT3检验；以相关数据做相关性分析和二元线性回归方程。

2 结 果

2.1药线灸对海马M受体与CREB含量的影响 在M1受体、总M受体及CREB含量上：模型组、药物组及药线非穴组均比正常组显著降低(P<0.01，P<0.05)；模型组与药线非穴组间差异无统计学意义(P>0.05)，药线灸组与药物组均较二者有显著性升高(P<0.05)；药线灸组与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)；而总M受体方面，药线灸组显著高于药物组(P<0.01)。

在M2受体含量上：模型组比药线非穴组及正常组均显著性升高(P<0.010)，药线非穴组与正常组差异无统计学意义(P>0.05)；药线灸组与药物组均较模型组显著性降低(P<0.05,P<0.01)；药线灸组与正常组、药线非穴组比较均差异无统计学意义(P>0.05)，而药物组显著高于正常组及药线非穴组(P<0.01)；药物组与药线灸组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组海马总M受体、M1受体、M2受体与CREB含量比较

2.2药线灸对大鼠海马M受体与CREB含量影响的相关及二元线性回归分析 正常组、模型组、药线灸组、药物组、药线非穴组M1受体、总M受体与CREB均呈显著正相关性(r=0.953、0.943、0.808、0.657、0.865、0.961、0.927、0.813、0.882、0.683，均P<0.05)，M2受体与CREB呈显著负相关性(r=-0.955、-0.915、-0.911、-0.952、-0.944，均P<0.05)。

3 讨 论

学习、记忆等认知功能障碍是VD的核心症状，本实验采用Kaneko等〔14〕、陈俊抛等〔15〕、刘存志〔16〕的MID大鼠造模及改进方法，通过结扎颈外动脉，经颈总动脉由颈内动脉注入血栓造成其支配区域的缺血缺氧或坏死，造成脑细胞及神经纤维功能的受损，模拟VD的病理。Morii〔17〕证明了MID大鼠模型存在记忆力障碍，并取得MID造模引起相关的大脑半球区域损害的病理证据，提示MID模型的可靠性；彭康等〔18〕进一步证明MID模型大鼠脑缺血后胆碱能神经元缺失是造成学习记忆能力减退的重要原因之一；张崇泉等〔19〕认为 MID模型非常接近于人类自然栓塞过程，很好模拟了人类VD的基本病因病理，表现了核心的学习记忆障碍症状。因此MID模型大鼠是评价抗VD治疗作用和探讨其作用机制研究，尤其是认知损伤最敏感的边缘系统如海马胆碱能记忆障碍机制研究较公认的动物模型。

哺乳动物学习、记忆活动的关键结构是海马，而海马学习、记忆功能又依赖M受体的调节〔20〕；海马神经元的退变、凋亡会使M受体相应减少，与VD记忆功能障碍相一致，而M受体由多种亚型组成，总M受体反映了多种受体亚型的综合作用；海马组织中以M1、M2受体分布最多，通常认为M1和M2受体是在海马水平调节学习记忆的主要参与者，海马内 M1受体兴奋、活性增强则引起 ACh 释放增加，则促进学习和记忆，而M2受体激动活性增强引起 ACh释放减少，导致大鼠的学习记忆功能减退；如研究表明脑内M受体减少或活性降低及M1受体mRNA表达的降低可能是VD大鼠认知障碍的基础〔21〕。CREB在哺乳动物的学习和记忆中起着关键作用，调控着细胞学习记忆功能；研究表明〔22〕血栓性VD模型大鼠海马CA1区CREB的表达下降，而针刺可以增加CREB的表达，达到保护神经元和改善大鼠学习记忆能力。因而总M受体及M1、M2受体、CREB都在哺乳动物学习记忆活动起关键作用，其指标的检测能反映VD认知功能障碍的相关状态。基于前期“益气调血、扶本培元”药线灸改善中枢ACh代谢障碍的作用机制〔10〕的实验基础；本实验结果显示MID模型大鼠存在细胞膜总M受体、M1，M2受体及胞核CREB损伤降低的基础；不管生理上还是病理上，总M受体、M1受体与CREB均呈显著正相关性，M2受体与CREB呈显著负相关性；说明MID模型大鼠存在中枢胞外ACh信息传递障碍到胞内细胞信号转导障碍等系列发病机制，从而导致中枢胆碱能系统损伤突出的认知功能障碍；通过药线灸法或多奈哌齐药物治疗显示：(1)均有显著升高MID模型大鼠海马内M1受体含量，上调了中枢ACh递质含量，相应与细胞记忆相关的胞内CREB含量显著上调；M1受体与胞内CREB指标间呈正相关性，反映胆碱能神经元组织记忆与细胞记忆的一致性改变，从而改善VD认知功能障碍，而药线灸治疗显示一定的疗效优势；(2)均有显著降低MID模型大鼠海马内M2受体含量，上调了中枢ACh递质含量，相应胞内CREB含量显著上调；M2受体与胞内CREB指标间呈负相关性，反映胆碱能神经元组织记忆与细胞记忆的一致性改变，从而改善VD认知功能障碍，而药线灸治疗显示一定的疗效优势；(3)均有显著升高MID模型大鼠海马内总M受体含量，总体与中枢ACh递质含量升高一致，相应胞内CREB含量显著上调；且总M受体与胞内CREB指标间呈正相关性，反映胆碱能神经元组织记忆与细胞记忆得到一致性调整，从而改善VD认知功能障碍；由于总M受体反映了多种受体亚型的综合作用，实验总M受体检测结果水平作用大致反映与M1、M2受体水平的协同作用，保持与CREB含量的一致性改变，是以药线灸组协同改善VD认知障碍功能显示更好疗效。综合结果显示“益气调血、扶本培元”药线灸法可能经调控M受体及M1，M2受体、CREB信号通路的关键分子，起到调控中枢ACh递质信息传递的M受体及其胞内CREB细胞信号通路，在胆碱神经元组织记忆和细胞记忆等方面改善了VD中枢ACh障碍的发病机制，从而改善VD认知障碍功能；提示该药线灸法可能经由调控ACh-M受体-CREB信息信号通路起到改善VD认知功能障碍的作用机制。