L-茶氨酸对高蛋白饮食诱导大鼠行为变化的干预作用

宋玉欣，龚志华，张 娇，贺 麟，李兰兰，陈美艳，张杨玲，屈青云，肖文军

（湖南农业大学 茶学教育部重点实验室，国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128）

随着现代饮食结构的变化，公众在提倡“低脂饮食”的同时，海鲜、鱼类、肉类、奶类等动物蛋白食品的摄入与日俱增。研究表明，摄入相对过量的动物性蛋白易导致慢性疾病的发生[1]，增加健康风险，可能出现抑郁、焦虑症状，严重时可能产生自杀行为[2-3]。中枢神经递质是抑郁发生、发展的重要病理物质[4]，研究发现多巴胺（dopamine，DA）[5]、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）[6]、去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）[7]水平的降低，极易导致情绪低落以及动力、食欲明显下降。虽然市面上有许多抗抑郁的西药，但其常伴有毒副作用，因此，从植物中寻找安全、天然、高效的产物来防治抑郁、焦虑已成为社会需求和研究热点[8]。研究发现，合欢皮[9]、北五味子[10]、香附[11]等植物源天然产物具有抗焦虑作用，能降低鼠脑内中枢神经递质含量，改善自主行为。

新食品原料L-茶氨酸是主要存在于茶叶中的一种非蛋白质氨基酸，具有抗氧化[12]、降血压[13]、预防糖尿病[14]、提高免疫力[15-16]、提高学习能力[17]、改善大脑认知能力[18]等多种生理功能，且安全、无毒副作用。研究表明，L-茶氨酸的谷氨酰γ-乙基酰胺结构与谷氨酰胺的谷氨酸γ-羧基酰胺结构十分类似，同时其分解代谢产物谷氨酸是合成谷氨酰胺的前体物质，可通过改变机体中谷氨酸、谷氨酰胺浓度达到神经保护的作用[19]。目前关于自主行为的营养干预研究主要集中于通过噪声刺激、潮湿垫料、夹尾等[20]方法建立大鼠或小鼠慢性不可预知温和应激模型，鲜见高蛋白饮食所致抑郁或焦虑的营养干预研究。为此，本研究通过对不同水平高蛋白饮食的SPF级6 周龄SD雄性大鼠进行40 d的灌胃实验，采用旷场和明暗箱行为学实验观察以及生理生化表征的方法，探究不同剂量L-茶氨酸对不同水平高蛋白饮食SD大鼠自主行为的影响，以期为高蛋白饮食的多元化营养干预及L-茶氨酸深层次利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

SPF级6 周龄雄性SD大鼠160 只，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK（湘）2016-0002，实验动物质量合格证编号：43004700063552。

普通维持饲料（蛋白质供能比20%）、低水平高蛋白饲料（蛋白质供能比30%）、中水平高蛋白饲料（蛋白质供能比40%）及高水平高蛋白饲料（蛋白质供能比50%）[21]均由北京华阜康生物科技有限公司提供，饲料配方如表1所示。

表 1 不同水平高蛋白饲料组分及三大供能营养素比例Table 1 Components and proportions of three major energy-supplying nutrients in high-protein diets

L-茶氨酸（纯度≥98%）湖南省三福生物科技公司；0.9%氯化钠注射液湖南科伦制药有限公司；5-HT、NE、DA酶联免疫吸附测定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒上海茁彩生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

多功能酶标仪赛默飞世尔（上海）仪器有限公司；MIKRO22R型台式冷冻离心机德国Hettich公司；自制旷场箱（100 cm×100 cm×50 cm）的无盖木箱，箱子底部用实线划分为2 5 个长宽均为20 cm×20 cm的小方格，中间9 格为中央区域，其余16 格为外周区域）、自制明暗箱（实验装置由两个40 cm×40 cm×40 cm的正方形纸箱组成，其中一个纸箱为暗箱，全遮光；另一个纸箱去盖；中间由一条不透光的纸质通道连接，使大鼠可以无阻碍地在两个纸箱走动）。

1.3 方法

1.3.1 动物实验设计

参考文献[17,22-23]结果确定L-茶氨酸剂量。将160 只大鼠根据体质量随机分为16 组，每组10 只，每3、3、4 只饲养于同一笼中，笼底铺垫杨木垫料，大鼠于温度（25±2）℃、相对湿度50%～70%、普通维持饲料、自由饮食饮水的条件下适应性饲养7 d，依据饲料种类及L-茶氨酸低（100 mg/（kgmb·d））、中（200 mg/（kgmb·d））、高（400 mg/（kgmb·d））灌胃剂量的区别，将各组分别编号：普通维持饲料组（P2CK）、普通维持饲料+L-茶氨酸低剂量组（P 2 L L）、普通维持饲料+L-茶氨酸中剂量组（P 2 M L）、普通维持饲料+L-茶氨酸高剂量组（P2HL）；低水平高蛋白饲料组（P3CK）、低水平高蛋白饲料+L-茶氨酸低剂量组（P3LL）、低水平高蛋白饲料+L-茶氨酸中剂量组（P3ML）、低水平高蛋白饲料+L-茶氨酸高剂量组（P3HL）；中水平高蛋白饲料组（P4CK）、中水平高蛋白饲料+L-茶氨酸低剂量组（P4LL）、中水平高蛋白饲料+L-茶氨酸中剂量组（P4ML）、中水平高蛋白饲料+L-茶氨酸高剂量组（P4HL）；高水平高蛋白饲料组（P5CK）、高水平高蛋白饲料+L-茶氨酸低剂量组（P5LL）、高水平高蛋白饲料+L-茶氨酸中剂量组（P5ML）、高水平高蛋白饲料+L-茶氨酸高剂量组（P5HL）。

将L-茶氨酸干预组的相应L-茶氨酸剂量溶解于生理盐水中，依据体质量进行灌胃，其他组灌胃生理盐水；每日上午8∶00灌胃，连续灌胃40 d。每只大鼠隔天称体质量、记录，及时按体质量调整灌胃量，每日定时称量当日剩余日粮并定时添加日粮。

1.3.2 明暗箱实验

实验第40天给药3 h后进行明暗箱实验，将整组大鼠放在暗箱中，头部朝明箱，立刻关闭盖子，给予无光条件，通过摄像装置观察并记录5 min内从暗箱到明箱的大鼠穿越次数以及在明箱的活动时间。实验过程中保持外界环境安静，每次放入大鼠前要清理粪便并喷洒酒精去除气味，以便进行下一组测试，确保每次检测结果的准确性。

1.3.3 旷场实验

在实验第40天下午进行旷场实验，保持室内安静，捏住大鼠尾巴，轻放于格内迅速离开，将大鼠置于中央方格同一位置，且每次放置时确保头部固定同一朝向；通过摄像装置观察并记录大鼠在5 min内活动的水平移动格数和后肢站立次数，结束后将大鼠放回饲养笼中，清扫粪便等残留物，喷洒酒精消毒并擦拭干净，以防影响后续实验。

1.3.4 样本采集

所有行为学观察实验完成后，大鼠禁食12 h。第41天，用质量分数10%水合氯醛溶液麻醉大鼠，腹部主动脉取血。血样在室温下静置30 min后，3 500 r/min离心10 min，吸取上清液，分装移至1 mL洁净EP管，置于-80 ℃保存，留待检测。

1.3.5 生化指标检测

按试剂盒说明书要求，检测大鼠血清DA、5-HT、NE质量浓度。

1.4 数据统计分析

采用SPSS 25.0软件对每组数据进行方差分析，各组间采用最小显著性差异法和邓肯检验（P＜0.05表示有显著性差异，为具有统计学意义），统计结果以平均值±标准差表示；对于不符合正态分布或正态转化无效的数据，采用Kruskal-Wallis秩和检验。使用GraphPad Prism 8.0.2软件作图。

2 结果与分析

2.1 L-茶氨酸对高蛋白饮食SD大鼠体质量及采食量的影响

表 2 不同水平高蛋白饮食对SD大鼠体质量和采食量的影响Table 2 Effect of high-protein diet on body mass and feed intake of SD rats

表2表明，与P2CK相比，P3CK、P4CK、P5CK各组大鼠的平均日采食量均显著减少（P＜0.05），主要原因是高蛋白饮食可引起大鼠厌食[24]。在第1天各组间体质量差异不显著，经过40 d不同水平蛋白饲料的喂养后，与P2CK相比，随蛋白质供能比的增加，不同水平高蛋白饲料组体质量逐渐减少，其中P5CK体质量减少达显著水平（P＜0.05），说明高水平高蛋白饮食可产生饱食感，减少采食量，减轻大鼠体质量，这与French等[25]的结论一致。

表 3 L-茶氨酸对高蛋白饮食SD大鼠体质量和采食量的影响Table 3 Effect of L-theanine on body mass and feed intake of SD rats fed with high-protein diet

如表3所示，通过不同剂量L-茶氨酸对不同水平高蛋白饮食大鼠营养干预40 d后，与P5CK相比，P5LL、P5ML、P5HL各组大鼠的平均日采食量均减少，但不显著，而其体质量则有所增加，其中P5LL的体质量增加显著（P＜0.05），说明L-茶氨酸对高蛋白饮食SD大鼠具有增加体质量的作用。

2.2 L-茶氨酸对高蛋白饮食SD大鼠旷场自主行为的影响

图 1 L-茶氨酸对高蛋白饮食SD大鼠旷场自主行为的影响Fig. 1 Effect of L-theanine on autonomous behavior of SD rats fed high-protein diet in open field

旷场实验是检测动物情绪行为的一种常用的方法，其结果的升高或降低会有不同的行为学解释[26]。图1A表明，与P2CK相比，P5CK大鼠的水平移动格数减少，但差异不显著；与P3CK、P4CK相比，P5CK大鼠的水平移动格数显著减少（P＜0.05）。由图1C可知，与P3CK、P4CK相比，P5CK大鼠在旷场箱的后肢站立次数显著减少（P＜0.05），这可能是低水平高蛋白饮食有利于提高认知能力，而高水平高蛋白饮食可能导致自主行为障碍的缘故[27]。

图1B显示，与P5CK相比，P5LL、P5ML大鼠的水平移动格数显著增加（P＜0.05），同时由图1D可知，P5LL、P5ML、P5HL各组大鼠在旷场箱的后肢站立次数均增加，其中P5LL、P5ML显著增加（P＜0.05），说明L-茶氨酸的干预可以改善大鼠因高蛋白饮食所致的旷场自主行为[28]。

2.3 L-茶氨酸对高蛋白饮食SD大鼠明暗箱自主行为的影响

图 2 L-茶氨酸对高蛋白饮食SD大鼠明暗箱自主行为的影响Fig. 2 Effect of L-theanine on autonomic behavior of SD rats fed high-protein diet in light/dark boxes

明暗箱是利用实验动物喜欢探究新奇环境，但又因厌恶明室中的亮光而退却，由此形成矛盾冲突状态，使穿箱次数减少，以此评价是否抑郁的行为学实验[29]。图2表明，与P2CK相比，P5CK大鼠在明箱中的停留时间显著缩短，进入明箱的次数显著减少（P＜0.05）；L-茶氨酸干预40 d后，P5LL大鼠在明箱中的停留时间显著延长（P＜0.05），同时P5LL、P5ML、P5HL各组大鼠进入明箱的次数显著增加（P＜0.05），说明L-茶氨酸具有改善大鼠因高蛋白饮食所致的明暗箱自主行为的作用。

2.4 L-茶氨酸对高蛋白饮食SD大鼠单胺类神经递质类物质的影响

表 4 L-茶氨酸对不同水平高蛋白饮食SD大鼠血清中单胺类神经递质类物质的影响Table 4 Effect of L-theanine on monoamine neurotransmitters in serum of SD rats fed high-protein diet

单胺类神经递质假说[30]中，抑郁症的发病与DA、5-HT、NE等单胺类神经递质及其受体含量、敏感度等密切相关。表4表明，与P2CK相比，P5CK大鼠血清中DA、5-HT、NE质量浓度减少无显著差异，但L-茶氨酸干预后，与P5CK相比，P5LL、P5ML、P5HL各组大鼠血清中DA、NE质量浓度显著升高（P＜0.05），且P5LL大鼠血清中5-HT质量浓度显著升高（P＜0.05），说明L-茶氨酸能够提高高蛋白饮食大鼠血清中单胺类神经递质DA、5-HT、NE的质量浓度，达到抗抑郁效果，这与彭彬等[28]的研究结果一致。

3 讨 论

随着生活水平的提高，人体摄入蛋白质的比例逐渐增大，长期高蛋白的摄入对人体的影响值得探讨。有研究指出，长期进食高蛋白食物可以产生肾脏损害[31]、肝脏损害[32]、降低免疫力[33]、增加患糖尿病风险[34]等，还会破坏血脑屏障的完整性[35]，导致认知水平下降、神经元变性[36]等神经疾病。

人体研究结果表明L-茶氨酸对高焦虑倾向的受试者有更好的抗抑郁或焦虑作用，能够起到神经保护功能[37]；Yin Cui等[38]通过小鼠行为学实验证明L-茶氨酸对小鼠的抗抑郁作用可能是由中枢单胺能神经递质系统介导；彭彬等[28]通过建立慢性不可预见性温和应激抑郁大鼠模型，发现L-茶氨酸组大鼠DA、5-HT、NE的质量浓度增高。同时，大多现有的抗抑郁药物主要是作用于单胺类神经递质系统[30]，在神经递质调节中起关键信号突触传递作用的单胺类神经递质DA、5-HT、NE的释放水平与抑郁症的发生有直接关系。可见，L-茶氨酸具有神经保护，改善因抑郁、焦虑等所致自主行为的作用。

为了明确何种高蛋白饮食水平可诱导焦虑或抑郁自主行为，本研究设置了4 个不同蛋白水平饲料组。通过对体质量测定、行为学观察及生化指标检测发现，只有蛋白质供能比为50%的高水平高蛋白饮食对大鼠自主行为及神经递质含量产生了显著的不良影响。因此，结果中只涉及到L-茶氨酸干预高水平高蛋白组的数据。一方面，高水平高蛋白饮食大鼠进入旷场箱的水平移动格数以及后肢站立次数均显著减少（P＜0.05），说明大鼠对新环境的探索能力受到影响；进入明箱的次数以及在明箱中的时间也显著缩短（P＜0.05），说明大鼠对新环境的好奇程度降低；L-茶氨酸干预能够提高大鼠的探索能力，改善大鼠因高蛋白饮食所致的旷场和明暗箱自主行为。另一方面，各水平高蛋白饲料组大鼠血清中DA、5-HT、NE质量浓度无显著差异，而L-茶氨酸干预的高蛋白饮食各组大鼠血清中DA、NE质量浓度显著升高（P＜0.05），且P5LL组大鼠血清中5-HT质量浓度显著升高（P＜0.05）。

因此，综合本研究中L-茶氨酸对高蛋白饮食SD大鼠体质量、采食量以及在旷场和明暗箱中的自主行为影响结果，可以认为，低水平高蛋白饮食有利于提高认知能力，而高水平高蛋白饮食则可能导致抑郁、焦虑等自主行为障碍；同时L-茶氨酸的干预可以改善大鼠因高蛋白饮食所致自主行为障碍的作用。后续可通过转录组学、蛋白质组学、代谢组学等技术方法，从各组间的差异基因、蛋白及代谢产物等方面进行相关机制研究。

低水平高蛋白饮食有利于提高认知能力，而高水平高蛋白饮食则可能导致抑郁、焦虑等自主行为障碍，L-茶氨酸具有改善高蛋白饮食所致焦虑或抑郁SD大鼠自主行为的作用，其机制可能与单胺类神经递质的代谢相关。