基于网络药理学的僵蚕主要药效作用研究∗

权浩浩，张晓凤，高 凯，杜 霞

1 陕西中医药大学，陕西 咸阳712046；2 陕西省中医医院；3 陕西省中医药研究院

僵蚕，亦称白僵蚕、天虫、僵虫、白僵虫，首见于《神农本草经》，为蚕蛾科昆虫家蚕（Bombyx moriL）4～5 龄的幼虫感染（或人工接种）白僵菌［Beauveria bassiana（Bas.）Vuillant］而致死的干燥体，多于春、秋季产生［1］。性味咸、辛、平，具有祛风定惊、化痰散结的功效。僵蚕单独使用或与其他中药配伍广泛应用于中医临床，涉及内、外、妇、儿各科，主治惊风抽搐、咽喉肿痛、皮肤瘙痒、颌下淋巴结炎、面神经麻痹等。僵蚕的主要化学成分为蛋白质、多肽、氨基酸、黄酮、有机酸和衍生物、甾体、微量元素等，主要具有抗凝血、抗惊厥、抗肿瘤、降低血糖等药理活性［2］，但具体作用机制尚不清楚。

网络药理学是在高通量组学数据分析、计算机模拟计算及网络数据库检索的基础上，进行生物网络的构建与分析，进而进行药物作用机制的研究及创新药物的发现。该方法从药物、靶点与疾病间相互作用的整体性和系统性出发，采用复杂网络模型表达和分析研究对象的药理学性质，特别适宜研究中药多成分、多靶点的作用关系，有利于揭示中药复杂作用机制［3-7］。本研究基于网络药理学方法，利用靶标识别、京都基因及基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析及网络构建等对僵蚕的药效成分及主要药理作用进行探究，为该药及其方剂的研究和临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 化学成分收集采用化学专业数据库（http：//www.organchem.csdb.cn/scdb/default.htm）及文献挖掘等方式，对僵蚕成分进行收集，并结合文献信息做适当增补删减，建立僵蚕化学成分数据库。

1.2 靶标识别及疾病关联通过PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库查找、下载所有化合物结构，利用中药网络药理学数据库和分析平台（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、Swiss Target Prediction 数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）作用靶点预测模型预测上述成分的作用靶点。其中利用化合物结构在Swiss Target Prediction 预测的靶点，依据可能性由大到小，选取前15 个靶点，利用TCMSP预测的靶点全部保留。由Uniprot（http：//www.uniprot.org/）数据库检索获取所有靶标的基因信息，将靶标名称转化为标准的基因名称，然后通过查找TTD、DisGeNET 等生物信息库，同时结合僵蚕现代药理作用研究将靶标映射在相关疾病中，进而得到相关疾病的靶标。

1.3 网络的构建及分析基于上述所获得的药材、僵蚕成分、靶点信息、疾病关联等数据，采用Cytoscape3.2.1 进行“药材-成分-靶标-疾病”网络构建，并利用Cytoscape 中的插件network analyzer 分析网络的拓扑性质，如：度值、介数中心值和紧密中心值等。

1.4 KEGG 通路富集分析利用DAVID 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）对所有靶点进行KEGG通路富集分析，将富集出的结果根据P＜0.05并结合生物信息学，选取靶点较多的通路，以图表形式呈现。

2 结果

2.1 化学成分收集共获得僵蚕39 个化学成分，其中化学专业数据库中检索到29 个，另外10个来源于文献挖掘，分别为槲皮素、山萘酚、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甘露醇、赤藓酸、尿嘧啶、β-谷甾醇、胡萝卜苷［8］。

2.2 靶标识别与疾病关联利用TCMSP、Swiss Target Prediction 靶点识别模型预测上述成分的作用靶点，39种成分共对应939个靶点（去重后415 个）。通过查找TTD、DisGeNET 等生物信息库将靶点映射于相应疾病。根据文献报道，僵蚕具有抗惊厥、抗癌、降低血糖、血脂等药理作用，并通过抗炎、调整免疫治疗支气管哮喘、疼痛类疾病［8-9］。基于此，将糖尿病、哮喘、肿瘤、疼痛相关疾病等作为研究重点，最终确定了与以上4 类疾病相关的靶点共351个（去重后224个），其中与糖尿病相关82 个，哮喘相关47 个，疼痛类疾病65个，肿瘤相关157 个，所有靶点以其基因名作为标记。

2.3 药材-成分-靶点-疾病网络的构建及分析采用Cytoscape 3.2.1 软件构建“药材-化合物-靶点-疾病”网络图，绿色圆形点代表僵蚕，蓝色菱形点代表化合物，紫色三角形点代表靶标，红色六边形点代表疾病。该网络共有459 个节点（其中，药材1个，化合物39个，靶标415个，疾病4个），1330 条边。利用network analyzer 插件分析网络的度值、介数中心值和紧密中心值3 个拓扑学性质参数，3 项值均高于平均值的化合物27个，靶标20个。Degree值排名前六的化合物分别是槲皮素、山奈酚、丙氨酸、天门冬氨酸、β-谷甾醇、谷氨酸。其中，槲皮素（degree=151）和山奈酚（degree=64）的度值远远高于其他化合物，属黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、降低血糖、血脂等多种生物活性作用［10-11］。见表1、图1。

表1 僵蚕的主要活性化合物信息

图1 僵蚕-成分-靶点-疾病网络

相关研究表明：槲皮素可通过减轻大鼠外周胰岛素抵抗、降低机体氧化应激水平、增加骨骼肌细胞表面GLUT4 表达、增强肝脏丙酮酸激酶活性、抑制胰岛细胞凋亡等诸多途径发挥降低糖尿病大鼠血糖的作用［12-14］。史丽颖等［15］发现：槲皮素组大鼠血清白三烯（leukotriene，LT）和IgE含量、肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）和全血嗜酸性粒细胞（eosinophils，EOS）的数量及肺组织炎症面积均较低，并推测槲皮素通过抑制炎性介质释放、降低炎性反应而发挥抗速发型过敏反应的作用。吴刚等［16］证明白僵菌素对支气管哮喘模型小鼠的气道炎症有抑制作用，能减少炎症因子的表达，可能促进炎症细胞凋亡。有文献［17］表明：槲皮素可通过抑制癌细胞增殖、增强药物及放射敏感性、逆转耐药性、抑制癌细胞迁移和侵袭、诱导癌细胞自噬等机制发挥抗癌作用，在体外可对多种癌细胞产生抑制作用。程杏安等［18］证实僵蚕所含成分β-谷甾醇和棕榈酸具有抗肿瘤活性作用，并呈现浓度依赖性。

槲皮素可能通过Wnt/β-catenin 通路抑制疼痛相关分子的表达，从而缓解神经病理性疼痛［19］。活性氧（reactive oxygen species，ROS）可减少脊髓神经元γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid,GABA）释放，从而增强神经性疼痛［20］，而槲皮素能清除过量的活性氧、从而减轻大鼠坐骨神经慢性缩窄性损伤模型的机械痛敏和热敏效应［21］。本研究显示20 个关键靶标Degree 值排名前六的靶标分别是PTGS2（degree=25）、OPRM1（degree=20）、CTSD（degree=18）、HDAC1（degree=16）、F2（degree=13）、PTGS1（degree=12），表示分别与25、20、18、16、13、12个化合物相连接。其中PTGS1和PTGS2 是前列腺素内源性过氧化物合酶（prostaglandin G/H synthase，PTGS）的2 个异构酶：结构性（PTGS1、COX-1）和诱导性（PTGS2、COX-2），PTGS2 又称为环氧化酶，是生成前列腺素的关键酶，属即刻早期反应基因，在静息细胞及正常生理状态下多数组织内检测不到其表达，但如炎性反应、激素、肿瘤启动子被高度诱导，从而催化花生四烯酸产生多种前列腺素类物质，导致疼痛和炎症反应［22］。同时，PTGS 及其产物参与机体肿瘤新生、血压调节、炎症反应、凝血平衡等多种生理和病理过程［23］，涉及多种疾病。组织蛋白酶D（cathepsin D，CTSD），主要表达于血管内皮细胞和纤维母细胞，是一种具有多种生物功能的蛋白水解酶，参与调解细胞的凋亡、细胞增殖、细胞基质退化和血管的生成等［24］。凝血酶原F2 在维持血液稳态、炎症反应及伤口愈合中均有重要的调节作用［25］。见表2。

2.4 KEGG 通路富集分析对糖尿病、哮喘、肿瘤、疼痛类疾病相关的靶点分别进行通路富集分析，初步结果显示：与糖尿病相关的靶点共富集在60条通路上，与哮喘相关的靶点共富集在19条通路上，与肿瘤相关的靶点共富集在116 条通路上，与疼痛相关的靶点富集在20 条通路上。根据P＜0.05，并结合生物信息学，选取靶点数较多的前10条通路，以图表的形式呈现。见图2。

表2 僵蚕关键靶标信息

图2 KEGG通路富集结果

图2A 显示：糖尿病相关的基因主要富集在代谢通路、神经活性配体-受体相互作用、PI3K-Akt信号通路等通路上，分别富集了18、14、9 个基因。其中代谢通路富集的靶点数目最多，分布了XDH、CYP3A4、GATM、PTGS2、GLUD1、PTGS1、ACACA、ADH1C、ADH1B、CYP1A2、GOT2、DGAT1、PYGM、MAT1A、GFPT1、MGAM、AKR1B1、HSD11B1 等18 个靶点。图2B 显示：哮喘相关的基因主要富集在神经活性配体-受体相互作用、钙信号通路、cAMP 信号通路等通路上，分别富集了15、9、7 个基因。其中OPRM1、PTGER3、PTGER4、TRPV1、TACR2、DRD2、GRIK2、TACR1、PRSS1、OXTR、GRM1、ADORA1、ADRB2、CHRM4、CHRM2 等15 个基因分布在神经活性配体--受体相互作用通路上。图2C 显示：肿瘤相关的基因主要是富集在癌症通路、神经活性配体-受体相互作用、PI3K-Akt信号通路等通路上，3 条通路分别富集了39、25、20 个基因。其中XIAP、PTGS2、BCL2、EGFR、AR、TP53、RAF1、BIRC5、PRKCB、MAPK1、JAK1、MAPK8 等39个基因富集在癌症通路上。图2D显示：疼痛相关的基因主要富集在神经活性配体-受体相互作用、钙信号通路、cAMP 信号通路等通路上，分别有25、14、7 个基因富集在相关通路上。其中OPRM1、GABRA2、DRD1、GABRA1、PTGER3 等25 个基因富集在神经活性配体-受体相互作用通路上。细胞色素P450 酶（CYP3A4）在激素合成分解、胆固醇合成和维生素D 代谢方面扮演重要角色［26］。刘鑫馗等［27］运用网络药理学方法构建四君子汤的作用靶点-疾病网络，发现PTGS2 参与了包括阿尔茨海默症、炎症、痛症、乳腺癌、前列腺癌等诸多疾病发生、发展过程。B 细胞淋巴瘤2 具有抑制凋亡和促进凋亡两种截然相反的生物学效应，其在调节细胞凋亡、肿瘤发生以及对抗癌细胞反应等方面发挥重要作用［28］。表皮生长因子受体对肿瘤细胞生长、细胞增殖、血管生成、肿瘤细胞侵袭、转移及细胞凋亡均有一定的调节作用［29］。

综上所述，僵蚕可通过多成分、多靶点、多通路治疗糖尿病、哮喘、肿瘤、疼痛类疾病。