蒙药蓝刺头对绝经后骨质疏松症大鼠瘦素、β2肾上腺素受体的影响∗

赵 军，师建平，董重阳，刘 岩，常 虹，刘 晋

1 内蒙古自治区中医医院，内蒙古 呼和浩特010020；2 内蒙古医科大学中医学院；3 内蒙古医科大学附属医院

绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是原发性骨质疏松症中最常见的一种，随着女性绝经后雌激素水平的降低，骨形成与骨吸收代谢失衡，导致骨量减少，骨微细结构发生变化，严重者发展为脆性骨折。其发病机制是成骨细胞和破骨细胞维持的骨代谢失衡。其中成骨细胞起着重要作用，而目前应用的抗骨质疏松药物（降钙素、二磷酸盐、雌激素等）多为抑制破骨细胞活性的药物，缺乏刺激成骨细胞活性或既刺激成骨细胞又抑制破骨细胞的药物。因此，深入研究具有以上优势的植物化合物防治骨质疏松症的机制，对提高患者的生活质量具有重要意义［1］。

骨质疏松属蒙医中“骨枯症”范畴。蒙医经典医籍《观者之喜》中有“老年人赫依偏盛，易骨枯，治以补为主，补暖补精，而抑赫依过剩……”的论述。老年人属“体热趋于减弱，显示赫依优势”的体质［2］，此时人体内“赫依”体素过剩，使体内“三根、七素”平衡失调，随着七素三根分解与吸收以及排泄功能的紊乱，精华与糟粕的分解不充分，骨之精华减少，从而发生骨枯症［3］，使骨脆性增加而易于骨折。蒙药蓝刺头味苦，性凉，效稀、柔、钝、轻，有固骨质、接骨愈伤、清热解毒，杀“黏”止痛等功效，主治筋骨折伤、骨伤热、刺痛、金创、疮疡等症［4］。有研究显示［5］：蒙药蓝刺头具有植物雌激素样作用，可通过雌激素样作用及促进骨形成对骨吸收、骨形成偶联有一定调节作用，能降低骨转换率，以此达到防治PMOP 的目的。蓝刺头可通过降低卵巢切除使雌激素水平急剧下降所致的骨高转换率，抑制骨吸收，调节骨吸收-骨形成偶联，防止骨量快速丢失，从而延缓绝经后骨量丢失的发生发展，以此起到防治PMOP 的作用［6］。为丰富蓝刺头基于”补肾壮骨”（经典雌激素通路）抗骨质疏松机制的实验研究内容，本研究进一步探讨蒙药蓝刺头对去卵巢大鼠瘦素（leptin，LEP）、股骨β2肾上腺素能受体（β2-adrenergic receptor，ADRβ2R）的调节作用，为基于蒙医“肾主骨，治以补暖补精”理论防治骨质疏松提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂蒙药蓝刺头制剂（广州中医药大学技术产业园有限公司）；强骨胶囊（北京岐黄制药有限公司，批号：20181103，规格：0.25 g/粒）；己烯雌酚片（合肥久联制药有限公司，批号：20181004，规格：0.5 mg/片）；水合氯醛（上海恒远生物技术发展有限公司，批号：H32022265，规格：100 g/瓶）；LEP Elisa 试剂盒、兔抗大鼠ADRβ-2R 抗体、DAB 显色试剂盒、PBS 缓冲液均由北京博奥森生物技术有限公司提供。

1.2 动物与饲养环境4 月龄雌性Wistar 大鼠70 只，平均体质量（250±20.00）g，购于内蒙古大学实验动物研究中心，实验动物合格证号：SCXK（蒙）2002-0001。实验室：内蒙古医科大学基础实验楼病理学实验室。大鼠为清洁级，饲养条件一致，标准饲料喂养，恒温、恒湿，室温（25±3）℃，空气湿度55%～65%，自然光照、通风良好、自由进食水，养于专用鼠笼内，每笼10 只，购回适应性饲养7天左右。

1.3 动物分组与模型复制将Wistar大鼠70只随机分为蓝刺头高、中、低剂量组及强骨胶囊组、己烯雌酚组、模型组、假手术组。PMOP 模型的复制参考文献［7］进行，假手术组不切卵巢只切除卵巢周围少量脂肪，造模缝合创口后5 天将大鼠阴道脱落细胞进行涂片并观察［1］。方法为将蘸有PBS 缓冲液的消毒棉签轻轻插入大鼠阴道，慢慢转动后移出，然后将蘸有阴道脱落细胞的棉签沿同一方向滚动，均匀涂抹于干净的载玻片上，迅速滴加36%甲醛溶液1滴覆盖载玻片涂片处，固定15 min，然后浸没于20%甲基蓝染液中染色45 min，蒸馏水冲洗透明，水溶性封片剂封片，普通光学显微镜下观察细胞的着色情况及形态。结果为假手术组大鼠阴道涂片充满有核细胞、白细胞和角质化细胞，而模型组中很少见上述细胞，表明造模成功，见图1—2。

图1 假手术组（甲基蓝染色，×400）

图2 模型组（甲基蓝染色，×400）

1.4 药物干预及标本采集正常饲养90 天后灌胃给药。蓝刺头高、中、低剂量组依据人鼠体质量比例及人鼠代谢速率比折算后分别以27.5000、13.7500、6.8750 mg/mL 的剂量灌胃给药，以低剂量组为临床等效剂量。强骨胶囊23.4375 mg/mL，己烯雌酚0.0313 mg/mL，均按成人剂量的有效量给药；模型组和假手术组灌胃相应体积的0.9%氯化钠溶液。同时将各组大鼠给药浓度换算为按大鼠体质量每克每天灌胃0.02 mL。处死前1 天停止给食，腹腔注射10%水合氯醛0.8 mL麻醉，心内采血约6～10 mL于离心管内，以3 000 r/min离心5 min后分离血清，检测血清LEP；处死大鼠剖取双侧完整股骨，分离附着的肌肉组织，保留完整骨膜，标记股骨，测定右侧股骨离体骨密度（bone mineral density，BMD）、骨小梁体积/组织体积（bone trabecula volume/tissue volume，BV/TV）；用4%甲醛溶液浸泡左侧股骨、大鼠子宫，室温保存10天，检测骨ADRβ2R表达及子宫重量/体质量（uterus weight/body weight，UW/BW）。

1.5 骨组织形态计量学测定采用显微CT 分析大鼠右侧股骨BMD、BV/TV及子宫UW/BW。

1.6 血清LEP 表达水平测定运用酶联仪检测各孔吸光度（OD）值，实验步骤按试剂盒说明书操作。

1.7 股骨头ADRβ2R表达测定采用免疫化学组织法检测左侧股骨头ADRβ2R表达。

1.7.1 大鼠左侧股骨脱钙方法将大鼠左侧股骨于4%甲醛固定液中固定10天后，用EDTA脱钙液连续脱钙20天，以能将针头刺入骨皮质为宜；然后采用免疫组织化学法检测股骨头中ADRβ2R的表达。

1.7.2 蜡块的制备及免疫组化染色常规包埋、染色（由内蒙古医科大学病理学学实验中心协助完成）。每组大鼠取5 张切片，每张切片随机选择5 个视野，在光学显微镜下观察各组染色情况，采用医学图像分析系统测定镜下细胞光密度值。ADRβ2R以细胞质、膜染成淡黄色或棕黄色为阳性。

1.8 统计学方法采用SPSS 13.0 统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨组织形态计量学变化显微CT 扫描大鼠右侧股骨近心端，结果显示：1）与假手术组比较，模型组BMD、BV/TV及UW/BW降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；蓝刺头高、低剂量组BMD、BV/TV 降低明显（P＜0.05），而UW/BW 升高明显（P＜0.05）；2）与模型组比较，蓝刺头中剂量组及己烯雌酚组BMD、BV/TV 及UW/BW 升高，差异有统计学意义（P＜0.01），而蓝刺头高、低剂量组升高不显著（P＞0.05）；3）蓝刺头中剂量组、己烯雌酚组、假手术组之间BMD、BV/TV 比较差异不明显（P＞0.05），UW/BW比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠组织形态计量学比较（±s）

表1 各组大鼠组织形态计量学比较（±s）

注：与模型组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；与假手术组比较，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

2.2 血清LEP 水平与假手术组比较，模型组大鼠血清LEP升高显著（P＜0.01），蓝刺头高、低剂量组升高（P＜0.05）；与模型组比较，蓝刺头中剂量组LEP 降低明显（P＜0.01），己烯雌酚组LEP 降低（P＜0.05），蓝刺头高、低剂量组差异无统计学意义（P＞0.05）；蓝刺头中剂量组、己烯雌酚组、假手术组之间LEP比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血清LEP含量比较（±s）

表2 各组大鼠血清LEP含量比较（±s）

注：与模型组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；与假手术组比较，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

2.3 各组大鼠左侧离体股骨头ADRβ2R表达与假手术组比较，模型组ADRβ2R表达升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，蓝刺头中剂量组ADRβ2R降低明显，差异有统计学意义（P＜0.05），蓝刺头高、低剂量组差异无统计学意义（P＞0.05）；与蓝刺头高、低剂量组比较，蓝刺头中剂量组、强骨胶囊组、己烯雌酚组、假手术组ADRβ2R 降低，差异无统计学意义（P＜0.05）；蓝刺头中剂量组、强骨胶囊组、己烯雌酚组、假手术组比较，ADRβ2R 差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3、图3。

表3 各组大鼠左侧离体股骨头ADRβ2R光密度值比较（±s）

表3 各组大鼠左侧离体股骨头ADRβ2R光密度值比较（±s）

注：与模型组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；与假手术组比较，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

图3 各组大鼠左侧离体股骨头ADRβ2R表达情况（免疫组化染色，×400）

3 讨论

交感神经系统对骨量调控具有重要作用。交感神经系统广泛分布于外周组织器官，骨小梁和成骨细胞附近有交感神经纤维，成骨细胞和破骨细胞上都具有ADRβ2R［8］。骨组织能通过神经骨骼信号通路调节骨骼系统微循环营养环境，通过交感神经末梢直接释放神经递质调节骨代谢。近年研究发现LEP 对骨代谢有至关重要的调控作用。LEP 介导的交感神经活动能抑制骨组织形成［9］，LEP 可透过大脑血脑屏障作用于下丘脑神经细胞，刺激兴奋外周交感神经系统，成骨细胞表面的ADRβ2R 介导其发挥作用，ADRβ2R 被激活后可促进LEP 和白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）等破骨因子的表达［10］，进而促进破骨细胞生成和分化，导致骨量下降，骨微结构破坏，从而抑制骨形成［11-12］。成骨细胞和破骨细胞上均存在ADRβ2R，β2受体激动剂可刺激骨髓破骨细胞生成而增强人和大鼠成熟破骨细胞的骨吸收活性［13］，导致骨量下降；相反，抑制该受体会促进骨形成，增加骨量。ADRβ2R 拮抗剂能刺激成骨细胞上ADRβ2R，能下调成骨细胞分化，降低核心结合因子α1 的表达［14］；外周交感神经系统通过骨组织表面ADRβ2R抑制骨形成。

LEP 是一种能引起摄食减少、体内能耗增加的抗肥胖因子，近来研究表明它同样参与了骨形成的调节［15］。LEP 在中枢抑制骨形成。LEP 抑制骨形成的中枢神经通路与硫葡萄糖敏感的神经元有关，与LEP 抑制食欲效应的促黑色素和促阿黑皮素原途径无关，交感神经系统参与了该途径［16］。LEP在外周促进骨形成。骨细胞有LEP受体表达，LEP 可直接作用于成骨细胞，促进其分化和成熟。LEP是骨重建的重要调节剂。

本研究中与模型组比较，己烯雌酚组治疗效果显著，大鼠BMD、BV/TV、UW/BW均增加（P＜0.01）；蓝刺头高、低剂量组增加不显著（P＜0.01）；蓝刺头中剂量组治疗效果与强骨胶囊组相似。说明在骨组织形态学结构变化方面，蓝刺头防治模型大鼠绝经后骨质疏松有效，中剂量组表现明显。模型组血清LEP 和股骨头ADRβ2R 的表达量显著高于假手术组（P＜0.05），说明大鼠在人为去卵巢术后体内LEP 含量增高，股骨ADRβ2R 表达上升，骨破坏作用增强。蓝刺头低、高剂量组与模型组相比，血清LEP 和股骨头ADRβ2R 的表达均未见明显差异（P＞0.05），说明在一定浓度范围内，蓝刺头可抑制去卵巢大鼠血清LEP 和股骨头ADRβ2R 的表达，从而起到一定的骨保护作用。

“肾主骨生髓”是中医肾脏生理功能的一个重要组成部分，同时也是蒙医“骨枯症”的重要内容。蒙医认为人年幼时发病以巴达干为主，青壮年以稀日为主，老年以赫依为主。骨是蒙医“三元”气（赫）所存之区，所以骨骼的生长和功能取决于肾气的盛衰。老年人赫依偏盛，易骨枯，治以补为主，补暖补精。因此，无论中医还是蒙医，“补肾壮骨”治法均应贯穿始终，而蒙药蓝刺头是蒙医补肾常用药。本研究中大鼠去卵巢后血清LEP 和股骨头ADRβ2R 的表达均明显增高，而蒙药蓝刺头能降低LEP 和股骨头ADRβ2R，效果与己烯雌酚、强骨胶囊相当，能显著提高去卵巢大鼠骨密度及骨形态学指标，起到骨保护作用。这种效应可能通过蒙药蓝刺头下调LEP 和ADRβ2R 表达，抑制破骨细胞生成和分化，进一步促进骨形成，增加骨量有关。这为蒙药蓝刺头依据“肾主骨，治以补暖补精”理论防治PMOP 提供了实验依据，但详细机制和作用通道还需进一步研究。