刺山柑对佐剂型关节炎大鼠Th17/Treg 免疫失衡的影响∗

霍新慧，徐海燕，樊思恩，赫吉铭，党 欢

新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐830054

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）主要表现为进行性、慢性、对称性多关节炎，RA 不仅直接导致关节疼痛、肿胀、功能下降，还可累及全身多个器官，严重影响人类健康和生活质量［1］。RA 的病因至今尚未明确，一致认为感染和自身免疫紊乱是其发生的关键因素［2］，在免疫机制方面主要与T细胞亚群数量和功能密切相关［3］。

刺山柑（Capparis Spinosa）又名槌果藤，野西瓜、老鼠瓜，新疆民间用该药外敷治疗RA 历史悠久［4］。本实验在建立佐剂型关节炎大鼠模型的基础上通过检测大鼠血清白细胞介素17(interleukin-17，IL-17)、IL-6、IL-10、IL-23及转化生长因子β(tranforming growth factor-β，TGF-β)含量，探讨新疆特色药材刺山柑对类风湿性关节炎可能的免疫调节机制，为临床应用刺山柑治疗RA提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF 级Wistar 大鼠40 只，体质量（180±20）g，雌雄各半，购于新疆医科大学动物中心，实验动物合格证号：SYXK（新）2016-0002，动物标准住宿条件为温度（22±2）℃，湿度55%～60%，明暗交替各12 h，自由饮食、摄水，屏障环境质量合格证：65000700000749。

1.2 主要药物与试剂刺山柑（新疆新特药有限公司，新疆医科大学中医学院中药系药物资源教研室鉴定）；甲氨蝶呤片（上海医药有限公司信谊制药厂，批号：161003，规格2.5 mg/片）；完全弗氏佐剂（Sigma公司，批号：F5506）；IL-17、IL-6、IL-10、IL-23及TGF-βELISA检测试剂盒（美国Bim公司，批号：B164775、5SNCCTLQCA、MJPMS5HZNT、JHNHCJX3UZ、3RULJ3FEUH）。

1.3 模型制备左后足跖底部皮肤常规消毒，拉直后肢，用1 mL注射器皮内注射完全弗氏佐剂（每只0.1 mL）。造模3 天后评定模型成功与否：无关节红肿计0 分；足小趾关节红肿计1 分；趾关节和足趾肿胀计2 分；踝关节以下均红肿计3 分；包括踝关节在内的全部足爪的肿胀计4 分。关节炎指数（arthritis index，AI）即每只大鼠四肢评分分数之和。评分达到6分以上即为造模成功。

1.4 分组与干预大鼠适应性喂养3 天后称重标记，采用随机数字表法选取10 只为正常组，其余大鼠均进行造模，将造模成功的大鼠再次称重后按照体质量分层原则随机分为模型组、阳性药组和刺山柑组，每组10 只。阳性药组将甲氨蝶呤均匀混合于0.9%氯化钠溶液，按照0.1 mg/100 g的剂量灌胃，每3 日1 次（每周2 次），共灌胃3 周。刺山柑组将刺山柑果实打粉粗提取，与45°白酒和蛋清（1∶2）混合均匀，适量外敷于大鼠左后足踝，纱布包裹并固定，敷药每日1 h，连续敷药6 天（1 个疗程），间休1 天，共敷药18 天（3 个疗程）。敷药过程中观察大鼠，以防纱布脱落大鼠舔舐药物。

1.5 观察指标

1.5.1 一般情况每日观察大鼠精神状态、饮食摄水、活动度、毛发色泽和排便等一般情况。

1.5.2 AI 指数造模后3 天及每个疗程后评价AI指数。

1.5.3 足爪容积造模和每个疗程后采用排水法测量足爪容积。首先用标记笔在大鼠踝关节上方约l cm处画圈做为标记，将水注满10 mL玻璃刻度管，保持大鼠足部垂直插入水中至标记处后取出，动作尽量保持轻柔，再用装满水的5 mL注射器加水至原有水面高度，记录注射器中剩余水量，其差值即为足爪所排出的水量，每次由专人进行测量，每次每只足爪测量2次取平均值。

1.5.4 ELISA 法检测血清细胞因子含量末次给药、治疗和行为学测定后禁食禁水12 h，腹腔注射1%戊巴比妥纳（50 mg/kg）麻醉，将大鼠仰头固定于手术台，腹主动脉采血，真空管收集全血标本，室温放置1 h 后离心半径13.5 cm，3000 r/min 离心15 min，取上清液-20℃保存。采用ELISA 法检测大鼠血清IL-17、IL-6、IL-10、IL-23和TGF-β含量。

1.6 统计学方法采用SPSS 17.0 统计软件分析数据，计量资料以±s表示，组间两两比较方差齐时采用LSD-t法，方差不齐采用Dunnett"s T3法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况大鼠造模后出现体质量增长缓慢、食欲下降，足部明显肿胀、红肿，活动明显受限。

2.2 AI 指数评分大鼠造模后3 天AI 指数评分各组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。干预后（第1疗程），各组AI指数较模型组下降（P＜0.01），且在2、3疗程有下降趋势。见表1。

表1 各组大鼠不同时间点AI指数评分比较（±s） 分

表1 各组大鼠不同时间点AI指数评分比较（±s） 分

注：*表示与模型组比较，P＜0.01

2.3 大鼠足爪容积与正常组比较，造模后各组大鼠足爪容积均增加（P＜0.01）；第1 疗程刺山柑组与正常组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；第2 疗程阳性药组与正常组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，第1 疗程刺山柑组降低（P＜0.05），阳性药组在第2疗程降低（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠不同时间点足爪容积比较（±s） mL

表2 各组大鼠不同时间点足爪容积比较（±s） mL

注：与正常组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；与模型组比较，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01

2.4 血清IL-17、IL-6、IL-10、IL-23 和TGF-β 含量与正常组比较，模型组血清IL-17、IL-6、IL-23升高（P＜0.05），TGF-β、IL-10 降低（P＜0.05）；阳性药组IL-6 高于正常组（P＜0.05），刺山柑组TGF-β低于正常组（P＜0.05）。与模型组比较，阳性药组和刺山柑组IL-17、IL-6含量均降低（P＜0.05），IL-10 升高（P＜0.01）；刺山柑组IL-23 含量降低（P＜0.05）；各组TGF-β水平与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各组大鼠血清IL-17、IL-6、IL-10、IL-23和TGF-β、比较（±s） ph/mL

表3 各组大鼠血清IL-17、IL-6、IL-10、IL-23和TGF-β、比较（±s） ph/mL

注：与正常组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；与模型组比较，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01

3 讨论

目前在RA 的治疗方面，西医主要以改善症状和缓解病情为主，民族医药在RA 的治疗方面疗效确切且安全、毒副作用小，有一定优势［5-6］。刺山柑属白菜花科山柑属植物，原产于地中海地区，目前在我国主要分布在新疆、西藏、贵州等地，尤其在沙漠分布较多的新疆地区资源丰富。刺山柑的根、果、叶均能入药，诸多药理实验表明，刺山柑果实较其他药用部位更具有抗急性炎症作用［7］。刺山柑在治疗RA 方面具有祛风除湿、消炎止痛等功效［8］，其可能的作用机制是免疫抑制［9］、镇痛、抗炎和抑制软骨和骨破坏等作用［10］。

调节性T 细胞（regulatory T cell，Treg）和辅助性T 淋巴细胞17（T helper cell 17，Th17）参与自身免疫疾病、肿瘤、感染等多种疾病的发生和发展［11］。研究表明，保持RA 免疫稳态存在Th17/Treg 平衡［12］，二者的抑炎及促炎性作用相辅相成［13-14］，在RA 患者外周血中Th17/Treg 比值明显升高，并且与疾病活动度相关［15］。

Treg在许多自身免疫性疾病中较为关键［16-17］，具有降低炎性细胞因子产生抗体分泌功能，维持机体免疫内环境平衡的作用。与Treg 功能相反，Th17 可促进自身免疫性疾病发生并介导促炎反应［18］，主要分泌炎症介质IL-17。IL-17在RA中起关键作用，是一种重要的促炎性、前炎性细胞因子和炎症反应的微调因子，能够通过多种途径参与RA 的炎症反应和进行性损害。IL-17 既可以通过与其他细胞因子的相互作用以促炎，又可进一步诱导产生、释放其他炎性因子，从而逐级放大炎症效应，导致RA 疾病的发生发展［19］。在维持Th17/Treg平衡中TGF-β的地位尤为重要，既可影响Th17细胞分化，又参与调节Treg 功能［1］。IL-10 是由Treg释放的有发挥其抑制T细胞及抗原呈递细胞的功能；IL-6 是多效性致炎性因子，由Treg细胞分泌产生，可诱导Th17细胞分化；IL-23主要在Th17细胞分化功能维持阶段起主要作用［9］。

本研究结果表明，佐剂型关节炎模型大鼠血清IL-17、IL-6、IL-23 升高，TGF-β降低。两种干预方法均可有效降低主要由Th17 细胞分泌的促炎因子IL-17，此外，刺山柑还可有效降低Treg细胞分泌的致炎因子IL-6，升高抑炎因子IL-10，对于Th17和Treg分化共用的，具有双向作用的调节细胞因子TGF-β，以及主要起Th17 细胞分化功能维持作用的IL-23 无显著改变，其具体机制有待进一步研究。因此，刺山柑可能是通过调节Th17和Treg 细胞水平，改善佐剂型关节炎大鼠免疫细胞Th17/Treg 失衡状态，从而发挥其消炎及抑制足肿胀等作用。