金刚藤及小果倒地铃合剂对STZ 诱导的糖尿病小鼠胰腺β 细胞的抗炎及抗氧化作用∗

谢 科，翁 静，李 骐，尚晓丽，杨 斌，钱兴勇，刘 威△

1 楚雄医药高等专科学校基础医学系，云南 楚雄675005；2 楚雄州人民医院

糖尿病是由遗传因素、免疫功能紊乱等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发一系列代谢紊乱综合征，是严重危害人类身体健康的一种疾病。国际糖尿病联盟数据显示，2014 年全世界有3.87 亿糖尿病患者，在高收入国家，2型糖尿病占85%～95%［1］。随着社会经济的发展、人们生活方式的改变（能量摄入增加和运动减少等）及人口老龄化等因素的影响，2 型糖尿病的发病在全球范围内，尤其在发展中国家呈逐渐加重的流行趋势［2］。目前尚缺乏根治糖尿病的药物，多以西药为主，能控制血糖，但随着用药时间的延长，耐药性的出现，降糖效果降低，器官损害严重，出现各种糖尿病并发症；中药治疗糖尿病具有降低血糖、减轻糖尿病对机体损害及控制、延缓糖尿病并发症，保护靶器官，高效、低毒，较少产生耐药性等优势［3］。金刚藤，又名菝葜，相关研究［4］发现，其提取物有较强的抗氧化活性，可有效抑制因胰岛素抵抗导致体内糖脂代谢紊乱所启动的氧化应激机制，减少氧化应激对胰岛β细胞的损伤和功能抑制。小果倒地铃为无患子科小果倒地铃属植物，有研究［5］发现小果倒地铃叶乙醇提取物能降低血糖和糖化血红蛋白（glycosylated hemoglobin，HbA1c），增加胰岛素和血红蛋白水平。笔者团队就金刚藤+小果倒地铃合剂（以下简称“合剂”）的降血糖作用进行研究，探讨合剂对成模小鼠的胰腺修复作用，为合剂药理学的进一步研究提供参考，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试药及相关药剂金刚藤和小果倒地铃购自云南楚雄市药材市场，已通过楚雄医药高等专科学校相关专家鉴定。其中小果倒地铃提取物由本实验室经乙醇提取法取得。盐酸二甲双胍片（山东凤凰制药股份有限公司，批号：1803312）；胰岛素检测试剂盒(Mouse Insulin ELISA Kit，RayBiotech,货号：Inc）；葡萄糖测试盒（中生北控生物科技股份有限公司，批号：193691）；链脲佐菌素（streptozotocin，STZ，美仑生物，批号：MB1227-1g）；三诺血糖测试纸（三诺生物传感股份有限公司，批号：4801NB）；兔抗Tribble 同源蛋白3（TRIB3）多克隆抗体购自德国Calbiochem 公司；兔抗小鼠C/EBP 同源蛋白（CHOP）高亲和性单克隆抗体购自美国Sigma公司。

1.2 仪器设备CA400型全生化自动分析仪（日本谷野株氏会社）；LD5-10 型离心机（北京医疗器械有限公司）；型移液枪（上海佳安分析仪器厂）；全自动血糖仪［艾康生物技术（杭州）有限公司，型号（艾科·灵睿），标准编号：YZB/浙4540-2015］；电泳仪（美国Bio-Rad 公司）；9602A 酶标仪（北京艾普生物设备有限公司）。

1.3 实验动物8 周龄KM 雄性小鼠30 只，体质量（200±20）g，由楚雄医药高等专科学校实验动物中心提供，实验动物合格证号：43004700050652，适应性喂养1周。

1.4 方法

1.4.1 动物模型制备与分组8 周龄KM 雄性小鼠30 只，适应性喂养1 周，随机分为对照组10 只（空白对照组和合剂对照组）和造模组20 只，并测定两组零基准血糖值和初始体质量；空白对照组常规饲养，正常饮水，灌胃生理盐水；合剂对照组常规饲养，正常饮水，灌胃合剂13.5 g/kg；各组按饲养方法饲喂4 周，每周测血糖和体质量；第5 周开始将造模组小鼠腹腔注射STZ（40 mg/kg），连续注射5 天，对照组注射枸橼酸钠缓冲溶液；最后1次注射后72 h（禁食12 h）小鼠尾静脉采血，血糖值大于11.1 mmol/L的小鼠为建模成功小鼠，选择15只成模小鼠。

1.4.2 给药方法将成模小鼠随机分为模型组、合剂组及二甲双胍组。金刚藤小果倒地铃合剂制备：采取水萃法，取金刚藤30 g与小果倒地铃60 g混合，10倍加水量，浸泡1 h，煎煮3次，第1次2 h，第2、3 次1 h，提取液分别过滤合并，将滤液置蒸发皿中水浴蒸干，于105℃干燥3 h 取出称重，将蒸发皿室温放置0.5 h 后再干燥1 h 后称重，反复操作，至两次质量差小于5%，扫出蒸发皿中的金刚藤小果倒地铃干膏称重备用，算出膏率和生药含量系数并记录；出膏率（%）=干膏质量/生药质量×100%；生药含量系数=生药质量/干膏质量，计算所得干膏率为26.5%。将干膏换算成生药含量并配制成0.675 g/mL浓度的溶液，冰箱冷藏备用。1）空白对照组：常规饲养，正常饮水，灌胃生理盐水，连续8 周；2）合剂对照组：常规饲养，正常饮水，灌胃合剂13.5 g/kg，连续饲养8 周；3）模型组：饲喂高糖高脂饲料，正常饮水，灌胃生理盐水，连续8 周；4）合剂组：饲喂高糖高脂饲料，正常饮水，灌胃合剂13.5 g/kg，连续8周；5）二甲双胍组：饲喂高糖高脂饲料，正常饮水，灌胃二甲双胍片溶液250 mg/kg，连续8周。

1.5 指标检测分别于给药前和末次给药后1 h测定成模组和对照组小鼠空腹血糖、血浆胰岛素水平；切除小鼠部分胰腺组织匀浆后采用ELISA法检测肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）及核转录因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）水平；Western blot法检测胰腺组织TRIB3及CHOP蛋白表达。

1.6 统计学方法采用SPSS 20.0 软件分析数据，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；各指标间相关性采用多元线性回归方程，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 FBG 和血浆胰岛素水平FBG 和血浆胰岛素水平空白对照组与合剂对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与空白对照组和合剂对照组比较，末次给药后模型组、合剂组、二甲双胍组空腹血糖升高，胰岛素降低（P＜0.05）；与模型组比较，合剂组FBG降低，胰岛素升高（P＜0.05），见表1。

2.2 炎症指标及TRIB3、CHOP 蛋白表达水平空白对照组和合剂对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与空白对照组、合剂对照组比较，末次给药后模型组、合剂组、二甲双胍组TNF-α、NO、ROS、NF-κB 及TRIB3、CHOP 升高（P＜0.05），合剂组低于模型组（P＜0.05），见表2—3、图1。

2.3 炎症指标与相关蛋白表达水平的相关性TRIB3、CHOP 表达与TNF-α、NO、ROS、NF-κB 水平呈显著正相关（P＜0.05），见表4。

表1 各组小鼠FBG和胰岛素水平比较（±s）

表1 各组小鼠FBG和胰岛素水平比较（±s）

注：#表示与空白对照组和合剂对照组比较，P＜0.05；*表示与模型组比较，P＜0.05

表2 各组小鼠炎症指标比较（±s）

表2 各组小鼠炎症指标比较（±s）

注：#表示与空白对照组和合剂对照组比较，P＜0.05；*表示与模型组比较，P＜0.0

图1 TRIB3与CHOP蛋白表达水平（HE，×200）

表3 各组小鼠相关蛋白表达水平比较（±s）

表3 各组小鼠相关蛋白表达水平比较（±s）

注：#表示与空白对照组和合剂对照组比较，P＜0.05；*表示与模型组比较，P＜0.05

表4 炎症指标与相关蛋白表达水平的相关性分析

3 讨论

2 型糖尿病的发生发展均伴随胰岛β细胞功能的进行性减退，改善胰岛β细胞功能、抑制β细胞凋亡是延缓2 型糖尿病进展和并发症发生的重要作用靶点［6］。尽管当前可用的药物（例如胰岛素和其他降血糖药物）可有效控制高血糖，但许多糖尿病患者最终会出现血管并发症［7］。队列研究［8］表明，残留的β细胞功能可抵抗糖尿病并发症的发展，表明可以长期保存β细胞质量/功能的治疗方法具有重要价值，似乎内源性胰岛素释放的增加较外源性胰岛素替代具有多个优势。因此，在早期诊断的患者中保持β细胞存活并在慢性糖尿病患者中恢复β细胞质量/功能将是糖尿病长期管理的一个重点。目前已有多项研究［9-10］显示，诱导胰岛β细胞凋亡的因素较多，主要以高血糖状态、内质网应激及氧化损伤为主。在氧化损伤诱导β细胞凋亡的多种途径中，NF-κB 的活化、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的激活已引起关注，但具体机制尚未阐明。近年中药制剂在糖尿病管理方面发挥了越来越重要的作用。诸多研究［11-12］表明，植物化学物质，特别是类黄酮对糖尿病的预防和治疗具有有益作用。研究含黄酮类成分的中药制剂是否通过抑制氧化和内质网应激以及激活其抗氧化，抗炎和抗凋亡作用来保护胰腺β细胞并改善其功能进而达到防治糖尿病的目的，已成为近年来相关专家关注的热点问题。

本研究发现，末次给药后模型组、合剂组、二甲双胍组空腹血糖水平高于对照组，血清胰岛素水平低于对照组，且与模型组比较，合剂组FBG 水平更低，血清胰岛素水平更高，说明金刚藤及小果倒地铃合剂能够有效降低机体血糖水平，保护胰腺β细胞功能和质量。提示金刚藤提取物有较强的抗氧化活性，可有效抑制因胰岛素抵抗导致体内糖脂代谢紊乱所启动的氧化应激机制，减少氧化应激对胰岛β细胞的损伤和功能抑制。小果倒地铃为无患子科小果倒地铃属植物，CHINNADURAI等［4］研究小果倒地铃叶的乙醇提取物降血糖作用，发现小果倒地铃叶乙醇提取物能降低血糖和糖化血红蛋白HbA1c 水平，增加机体胰岛素和血红蛋白水平。

此外，本研究结果显示，与对照组比较，模型组、合剂组、二甲双胍组TNF-α、NO、ROS、NF-κB 及TRIB3、CHOP 水平高于对照组，合剂组上述指标水平低于模型组；且多元线性回归分析结果显示TRIB3、CHOP 表达与TNF-α、NO、ROS、NF-κB 水平存在正相关。内质网是蛋白质合成、加工修饰的重要场所，且内质网应激是真核细胞的一种保护性应激反应；持续的内质网应激会激活细胞凋亡通路［13］。胰岛β细胞具有高度发达的内质网，其蛋白质合成分泌旺盛，这就使得内质网应激对β细胞功能和状态极为敏感。糖尿病患者机体处于持续高血糖状态，胰腺β细胞在长期高糖环境下会造成作为细胞器的内质网处于长期性应激反应，诱导细胞功能衰竭、损害细胞功能、减少细胞数量。这种高应激状态会导致胰岛组织中产生大量炎症因子，进而出现炎症级联反应，直接或间接作用于胰腺并损伤胰岛β细胞。NF-κB 的高表达会启动胰腺组织中的iNOS 因子，诱导NO 生成，触发内质网应激反应，造成胰岛β细胞凋亡；TNF-α受体（TNFR-1）活化会触发一系列细胞内信号，最终导致Caspases-3 和-7 的激活，导致β细胞凋亡；TNFR-1 的活化能够通过necrosome 的形成开始启动β细胞自噬和坏死的通路［14］。细胞内葡萄糖和FFA 的氧化会产生过量ROS/RNS，从而通过内在途径诱导β细胞凋亡。细胞内葡萄糖水平的升高促进了醛糖还原酶（一种消耗NADPH 的反应）产生的山梨糖醇；NADPH 的耗尽会减少还原型谷胱甘肽（一种重要的细胞内抗氧化剂）的再生，从而使细胞易于受到氧化损伤，ROS/RNS 水平升高会破坏蛋白质和DNA，从而诱导细胞凋亡或触发以自噬或坏死性死亡为终点的途径［15］。TRIB3 是重要的应激反应相关蛋白，其通过调控下游炎症因子、氧化因子、营养因子等来参与调节细胞增殖、迁移和凋亡。研究显示［16］，在内质网应激状态下抑制TRIB3 表达可降低细胞应激损伤所造成的细胞程序性凋亡。CHOP 作为C/EBP 转录因子家族成员，当内质网处于普通状态时，CHOP 蛋白处于低表达状态，当内质网应激时其表达会增加，故可作为衡量糖尿病动物胰岛内质网应激反应的指标［17］。

合剂的主要成分为金刚藤和小果倒地铃，两种中草药的化学成分均含有类黄酮成分；黄酮类化合物可通过增强酶促（例如过氧化氢酶，谷胱甘肽过氧化物酶，谷胱甘肽S 转移酶，超氧化物歧化酶）和非酶促（例如还原型谷胱甘肽）抗氧化剂来增强糖尿病动物β细胞的抗氧化能力；抗氧化能力的提高抑制了β细胞中ROS 的积累和脂质过氧化，因此可以保护它们免于自噬，凋亡或坏死。此外，有研究［18］表明，类黄酮对β细胞存活的有益作用与ER 应激标志物的减少有关。由于线粒体来源的ROS 在细胞因子敏感性NF-κB 的激活中起重要作用，因此类黄酮的抗氧化作用可能是抑制NF-κB激活和iNOS表达的原因。类黄酮可增加胰岛素产生细胞中热激蛋白（例如Hsp70）的基因表达［19］，热休克蛋白70 的上调显示增强了β细胞对NO、ROS和其他毒素（包括STZ）的抗性。

本研究受到实验动物数量的限制，且金刚藤和小果倒地铃降血糖的作用机理仍需进一步化学分离和药理学研究。

综上所述，金刚藤与小果倒地铃合剂可能具有通过抑制氧化和内质网应激以及激活其抗氧化、抗炎和抗凋亡作用来保护胰腺β细胞并改善其功能的潜力。