复方臭灵丹合剂质量标准研究

李江 陈凌云 付鹏 余晓玲

摘要：目的建立復方臭灵丹合剂的质量标准。方法采用TLC对桔梗和鱼腥草进行定性鉴别，依据《云南省中药材（民族药材）质量标准研究技术指导原则（试行）》对其进行分析方法验证及重现性考察。采用HPLC对合剂中的洋艾素和金丝桃苷进行定量分析，同时进行相关方法学的考察。结果桔梗和鱼腥草TLC鉴别色谱图中，供试品与对照药材相应位置上均显相同颜色的特征斑点，阴性无干扰，且分析方法验证与重现性考察均合格。洋艾素和金丝桃苷分别在2.59～55.47 μg/mL和4.02～51.68 μg/mL范围内线性关系良好，回归方程分别为Y1=43.24X-12.39（R=0.999 6）和Y2=63.82X-30.04（R=0.999 4），准确度试验中，平均加样回收率分别为100.06%和100.14%，RSD值分别为2.36%和2.74%（n=9），其余方法学考察均合格，洋艾素和金丝桃苷的平均含量分别为2.41 μg/mL和9.95 μg/mL。结论建立的质量标准稳定可行。

关键词：复方臭灵丹合剂;桔梗;鱼腥草;洋艾素;金丝桃苷;质量标准

中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1007-2349（2021）02-0058-06

Study on the Quality Standard of Compound Laggera Pterodonta Mixture

LI Jiang1， FU Peng1， CHEN Ling-yun1，2， YU Xiao-ling1， 3

（1. Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， China;

2. Key Laboratory of External Drug Delivery System and Preparation Technology Research in Universities

of Yunnan Province， Kunming 650500， China;

3. Traditional Chinese Medicine Hospital of Kunming City， Kunming 650011， China）

【Abstract】Objective： To establish the quality standard of Compound Laggera Pterodonta Mixture. Methods： TLC was used to qualitatively identify Platycodon grandiflorum and Houttuynia cordata. According to the "Technical Guidelines for Research on Quality Standards of Chinese Medicinal Materials （Ethnic Medicinal Materials） in Yunnan Province （Trial）"， the analytical methods were verified and reproducible. HPLC was used to quantitatively analyze the artemitin and hyperoside in the mixture， and the related methodology was investigated at the same time. Results： In the TLC identification chromatogram of Platycodon grandiflorum and Houttuynia cordata， the test product and the control medicinal material showed the characteristic spots of the same color on the corresponding positions， negative and no interference. The analytical method verification and reproducibility inspection were all qualified. Artemitin and hyperoside had a good linear relationship in the range of 2.59 to 55.47μg/mL and 4.02 to 51.68μg/mL， respectively. The regression equations were Y1=43.24X-12.39 （R=0.999 6） and Y2=63.82X-30.04 （R=0.9994）， respectively. In the accuracy test， the average sample recovery rates were 100.06% and 100.14%， respectively and the RSD values were 2.36% and 2.74% （n=9）， respectively. The other methodological investigations were qualified. The average contents of artemitin and hyperoside were 2.41 μg/mL and 9.95 μg/mL， respectively. Conclusion： The established quality standards are stable and feasible.

【Key words】Compound Laggera Pterodonta Mixture;Platycodon grandiflorum;Houttuynia cordata;Artemitin;Hyperoside;Quality standard

上呼吸道感染是以咳嗽、咽痛及发热等为主要症状，与细菌或病毒感染有关的疾病[1]，其发病机制与气道广泛炎症、气道的上皮细胞损伤、气道高反应性、气道神经炎症、β肾上腺素能受体功能的改变、M胆碱能受体功能的改变等有关，并通过炎症细胞、细胞因子、炎症介质、神经递质、神经肽、免疫球蛋白等起作用[2]，其治疗药物以抗病毒及抗生素类药物为主[3]。

复方臭灵丹合剂中臭灵丹为君药主要含洋艾素、金腰乙素、槲皮素等黄酮类成分[4]，具有清热解毒的功效，常用于治疗上呼吸道感染[5]，鱼腥药中金丝桃苷具有抑菌抗菌的作用[6]，西青果主要含多酚，类黄酮类成分，具有抗炎，抗菌作用[7]，其余滇柴胡、桔梗等药味对此过程亦有抑制作用[8-9]。全方合用，具清热解毒、抗菌消炎之功，用于治疗感冒、咳嗽、急性扁桃体炎、咽喉炎、腮腺炎等上呼吸道感染疾病。本研究对复方臭灵丹合剂中的两味药进行了薄层鉴别，以洋艾素及金丝桃苷为含量测定指标成分对其质量标准进行了研究，为该合剂后期抗病作用及机制研究奠定了基础。

1材料

1.1仪器Agilent 1100高效液相色谱系统（DAD检测器，美国Agilent公司）;Diamonsil C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm，迪马科技公司）;T-1000型电子天平（美国双杰兄弟有限公司）;AB265-SMETTLER TOLEDO分析天平（瑞士梅特勒-托利多集团）;WFH-203B三用紫外分析仪（上海精科实业有限公司）;SK2200HP超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）;薄层层析硅胶G板（青岛海洋化工分厂、青岛鼎康硅胶有限公司）。

1.2药品与试剂洋艾素对照品（批号：111879-201001）、金丝桃苷对照品（批号：111521-201507）、鱼腥草对照药材（批号：21046-201607）、臭灵丹对照药材（批号：121231-200301）均购自中国食品药品检定研究院;复方臭灵丹合剂（批号180613，180624，180712）由昆明市中医医院提供;乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1复方臭灵丹合剂的制备本品由昆明市中医医院提取，其制备方法如下：按方称取臭灵丹、西青果等味药，加水煎煮2次，每次1h，滤过，滤液合并浓缩至适量，加入适量蔗糖和防腐剂，搅匀，即得。

2.2定性鉴别及其方法学考察

2.2.1桔梗的薄层鉴别及其方法学考察取本品30 mL，加硫酸0.5 mL，加热回流1 h，放冷，用三氯甲烷振摇提取2次，每次20 mL，合并三氯甲烷液加水30 mL洗涤，弃去洗液，三氯甲烷液用3 g无水硫酸钠脱水，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL溶解，作为供试品溶液[10]。取桔梗对照药材0.5 g，加7%硫酸乙醇-水（1∶3）混合液20 mL，自上述“加热回流1h”起，同法制成对照药材溶液。取缺桔梗的复方臭灵丹合剂按供试品制备方法制备阴性样品溶液。按照2015年版《中国药典》（四部）通则0502进行试验，以硅胶G板为吸附剂，三氯甲烷-乙醚（1∶1）为展开剂[11]，10%硫酸乙醇溶液为显色剂，105 ℃下显色。结果显示，供试品与对照药材相应位置上均显相同颜色的特征斑点，阴性无干扰，分析方法验证及重现性考察中，各溶液最佳点样量均为10 μL，在15 ℃，25 ℃，35 ℃，50%、75%、90%湿度下[12]桔梗的TLC鉴别无明显差异，青岛海洋化工分厂和青岛鼎康硅胶有限公司的硅胶G板薄层板对鉴别无明显影响，所选三批样品检定结果均合格，故所建立的TLC鉴别方法稳定可行。结果见图1。

2.2.2魚腥草的薄层鉴别[13]及其方法学考察取本品30 mL，浓缩至10 mL，加乙醚萃取2次，每次10 mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加1 mL甲醇溶解，作为供试品溶液。取鱼腥草对照药材0.5 g，加乙醚20 mL超声10 min，滤过，滤液蒸干，残渣加1 mL甲醇溶解，作为对照药材溶液。取缺鱼腥草的复方臭灵丹合剂按供试品制备方法制备阴性样品溶液。按照2015年版《中国药典》（四部）通则0502进行试验，以硅胶G板吸附剂，甲苯-乙酸乙脂-甲酸（18∶6∶1）为展开剂，于365 nm紫外灯下检视。各项结果与“2.2.1”项中结果相同。结果见图1。

2.3洋艾素含量测定

2.3.1溶液的制备精密称取0.00243 g洋艾素对照品（含量以99.4%计），加甲醇定容至10 mL作为储备液，取1 mL储备液用甲醇定容至10 mL，作为对照品溶液（24.15 μg/mL）。本品摇匀后取100 mL，浓缩并定容至50 mL，精密移取定容液25 mL，水浴蒸干，干膏加少量甲醇浸润后移至50 mL容量瓶中加甲醇定容，超声10 min，滤过，并用10 mL甲醇洗涤容量瓶及滤渣，合并滤液及洗涤液，蒸干，残渣加甲醇定容至5 mL，滤过，作为供试品溶液。取缺臭灵丹的复方臭灵丹合剂按供试品制备方法制备阴性样品溶液。

2.3.2色谱条件及系统适应性试验色谱条件：C18柱为色谱柱;流动相为乙腈-2%甲酸溶液[14]（45∶55）;流速1 mL/min，波长350 nm;柱温30 ℃;进样量10 μL。系统适用性试验中，供试品色谱中洋艾素色谱峰与相邻色谱峰分离度为大于4.0，理论塔板数以洋艾素计不低于4000。结果见图2。

2.3.3线性关系及线性范围考察精密称取洋艾素对照品0.00279 g，加甲醇定容至5 mL，作为储备液，精密移取储备液1 mL，加甲醇定容至10 mL（55.47 μg/mL），取此溶液3 mL，加甲醇定容至5 mL，依次反复操作得33.28、19.97、11.98、7.19、4.31、2.59 μg/mL对照品溶液，按“2.3.2”项下色谱条件检测。以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程为Y1=43.24Y-12.39（R=0.999 6），表明洋艾素在2.59～55.47 μg/mL间线性关系良好。

2.3.4仪器精密度实验取“2.3.1”项下对照品溶液，按“2.3.2”项下色谱条件检测，连续进样6次，RSD值为0.78%，表明仪器精密良好。

2.3.5稳定性实验取“2.3.1”项下对照品溶液和供试品溶液，分别于0、4、8、12、16 h按“2.3.2”项下色谱条件检测，峰面积RSD值分别为1.55%和1.88%，表明对照品溶液及供试品溶液在16 h内稳定性良好。

2.3.6重复性实验取同一批样品（批号180406）6份，按“2.3.1”项下制备供试品溶液，“2.3.2”项下色谱条件检测，洋艾素平均含量为2.47 μg/mL，RSD为1.67%，表明重复性较好。

2.3.7准确度实验精密移取同一批样品9份（平均含量为2.47 μg/mL），每份50 mL，3份为1组，每组各精密加入0.4、0.5、0.6 mL对照品溶液（“2.3.1”项下中储备液，241.54 μg/mL），按“2.3.1”项下供试品制备方法制备供试品溶液，按“2.3.2”项下色谱条件检测，平均加样回收率为100.06%，RSD为2.36%，表明准确度较好。结果见表1。

2.3.8样品中洋艾素含量测定取3批样品，每批平行取2份，按“2.3.1”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按“2.3.2”项下色谱条件检测。结果显示，洋艾素平均含量为2.41 μg/mL，RSD值为2.36%。结果见表3。

2.4金丝桃苷含量测定

2.4.1溶液的制备精密称取金丝桃苷对照品（含量以94.3%计）0.00274 g，加甲醇定容至10 mL作为储备液（258.38 μg/mL），移取1 mL儲备液用甲醇定容至10 mL配得浓度为25.84 μg/mL作为对照品溶液。本品摇匀后精密移取10 mL，加等体积水饱和正丁醇萃取4次，合并正丁醇液减压回收溶剂至干，残渣加甲醇定容至5 mL，滤过，作为供试品溶液。取缺鱼腥草的复方臭灵丹合剂按供试品制备方法制备阴性样品溶液。

2.4.2色谱条件及系统适应性色谱条件：C18柱为色谱柱;流动相为乙腈-甲醇-水（11∶6∶83）;流速1.3 mL/min，波长360 nm;柱温40 ℃;进样量10 μL。系统适用性试验中，供试品色谱中金丝桃苷色谱峰与相邻色谱峰分离度大于3.0，理论塔板数以金丝桃苷计不低于5000，结果见图3。

2.4.3线性关系及线性范围考察精密移取“2.4.1”项下对照品制备液（258.38 μg/mL）1 mL，加甲醇定容至5 mL，取定容液3 mL加甲醇定容至5 mL，依次反复操作得51.68、31.01、18.60、11.16、6.70、4.02 μg/mL的对照品溶液，按“2.4.2”项下色谱条件检测。以峰面积为纵坐标，各对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y2=63.82X-30.04（R=0.999 4）。结果表明，金丝桃苷在4.02～51.68 μg/mL间线性关系良好的。

2.4.4仪器精密度实验取“2.4.1”项下对照品溶液，按“2.4.2”项下色谱条件检测，连续进样6次，RSD值为0.78%，表明仪器精密良好。

2.4.5稳定性实验取“2.4.1”项下的对照品溶液和供试品溶液，分别于0，4、8、12、16 h按“2.4.2”项下色谱条件检测，结果表明，对照品溶液及供试品溶液在16 h内稳定性良好。

2.4.6重复性实验取同一批样品（批号180406）6份，按“2.4.2”项下制备供试品溶液。按“2.4.2”项下色谱条件检测，金丝桃苷平均含量为9.74 μg/mL，RSD为1.84%，表明此方法重复性较好。

2.4.7准确度实验精密移取同一批样品9份（平均含量为9.74 μg/mL），每份5 mL，3份为1组，每组各精密加入0.15、0.2、0.25 mL对照品溶液（“2.4.1”项下中的储备液，质量浓度为258.38 μg/mL），按“2.4.1”项下供试品制备方法制备供试品溶液，按“2.4.2”项下色谱条件检测，平均加样回收率为100.14%，RSD为2.74%，表明准确度较好。结果见表2。

2.4.8样品中金丝桃苷含量测定取3批样品，每批平行取2份，按“2.4.1”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按“2.4.2”项下色谱条件检测。结果显示，金丝桃苷平均含量为9.95 μg/mL，RSD值为2.32%。结果见表3。

3讨论

桔梗定性鉴别中，在三氯甲烷-乙醚（2∶1）及二氯甲烷-乙醚（1∶2）[15]的基础上进行了展开剂种类的筛选和展开剂比例的优化，最终优选出三氯甲烷-乙醚（1∶1）最佳。鱼腥草定性鉴别中，分别采用乙酸乙酯、乙醚、三氯甲烷[16]萃取样品，蒸干，加甲醇溶解制成三种供试品，并以环己烷-乙酸乙酯（9∶1）、甲苯-乙酸乙脂-甲酸（18∶6∶1）、甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（20∶10∶1∶1）为展开剂进行了鉴别，最终优选出采用乙醚萃取，甲苯-乙酸乙脂-甲酸（18∶6∶1）为展开剂。薄层鉴别的分析方法验证中以《云南省中药材（民族药材）质量标准研究技术指导原则（试行）》为依据进行考察，15℃～35℃、50%～90%相对湿度、不同厂家的薄层板均对所建立的方法无明显影响。

因洋艾素及金丝桃苷具有抗菌抑菌的作用，为臭灵丹和鱼腥草中的有效成分，且在合剂存放至有效期后仍能测到较高的含量，故选二者为含量测定的指标性成分。因洋艾素为黄酮类成分，金丝桃苷为黄酮醇苷，试验中对采用双波长-HPLC法对二种成分同时进行测定进行了考察，以乙腈-0.2%醋酸（18∶82）、乙腈-2%甲酸（45∶55）、乙腈-0.1%磷酸（16∶84）、乙腈-甲醇-水（11∶6∶83）为流动相，并在此基础上进行了流动相比例，柱温的调整，均未能使两种成分同时达到分离度的要求，使得方法学考察难以合格，故最终采用了两种分析方法对两种成分分别进行测定。洋艾素含量测定时，供试品制备过程中对超声时间进行了考察（5，10，15 min），结果显示，超声10与15 min所测含量RSD至小于1.0%，5 min时含量明显小于10 min，故确定超声时间为10 min。含量下限拟定中，以平均含量的80%为下限，拟定本品含臭灵丹及鱼腥草分别以洋艾素和金丝桃苷计，不得少于1.90和7.90 μg/mL。