光动力疗法抗皮肤感染性疾病的研究进展

杨春燚 ， 张跃平 ， 王丽仰 ， 张 迪 ， 林德贵

(中国农业大学动物医学院 ， 北京 海淀 100193)

1 光动力疗法的概念及原理

光动力疗法(Photodynamic therapy，PDT)是指利用光敏剂和特定波长的光源，产生具有细胞毒性的物质，进行细胞杀伤作用的疗法；是一种非侵入性、副作用较小的治疗方式。该疗法利用具有光敏作用的光敏剂，在吸收特定波长的光能后跃迁到第一激发状态(First excited singlet-state，S1)，成为单线态光敏剂。单线态光敏剂分子不稳定，可以通过2种不同的弛豫过程回到基态：(1)单线态光敏剂放出所吸收的能量，直接从激发态回到基态，同时发出荧光；(2)激发态光敏剂通过系间窜越失去部分能量，跃迁至激发三线态(Excited triplet state，T1)。三线态光敏剂可与底物或周围的基态氧分子发生反应，产生具有细胞毒性的超氧化物或单线态氧，从而对局部的病原菌或肿瘤细胞等进行杀伤作用[1]，三线态光敏剂回到基态同时释放出磷光(封三彩版图1)。虽然光动力疗法的细胞毒性作用是非特异性的，但有研究表明，在体外试验中，使用亚甲蓝作为光敏剂对角质细胞的杀伤速率比对常见的皮肤微生物的杀伤速率慢18～200倍，说明对于病原微生物具有杀伤作用的治疗剂量不会对皮肤角质细胞产生明显的毒性作用[3]。

2 光敏剂

光敏剂是光动力疗法中重要的元素，一个合格的光敏剂需要具备低细胞毒性、无致畸性、选择性强等特点。目前最常用的光敏剂主要分为三类：吩噻嗪类、卟啉类和酞菁类。具有代表性的吩噻嗪类光敏剂包括亚甲蓝(Methylene blue，MB)、甲苯胺蓝(Toluidine blue，TBO)等。该光敏剂多以阳离子形式存在，可吸附在带负电荷的细胞膜上，在光照条件下直接损伤细胞膜诱导细胞死亡。卟啉类光敏剂分两代，血卟啉衍生物、二血卟啉醚均为一代，但因为其在体内滞留时间长，治疗后需要长时间的避光且治疗深度有限等缺点而逐渐被第2代卟啉类光敏剂所取代。第2代卟啉类光敏剂包括二氢卟酚、苯卟啉衍生物等。5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acid，5-ALA)本身不具备光活性，但可在体内转换为原卟啉Ⅸ(PpⅨ)，PpⅨ在特定波长的光照下能产生大量的单线态氧而产生抗菌作用。

新型光敏剂多在上述几类光敏剂的化学结构基础上进行改构提高其功效。近期也有不少使用植物提取物作为光敏剂的研究，如姜黄素、叶绿素。由于一些光敏剂的水溶性低、化学性质不稳定、生物利用度低等问题，也有使用脂质体或纳米颗粒包裹光敏剂以提高其利用度和选择性。

3 光源

光源的选择对于光动力疗法来说也是需要考虑的一个重要因素，包括光源的光谱范围、组织穿透性、能量密度等。激光由于其单色性好、相干性好、能量密度高等特点在光动力疗法中发展成为一种标准的治疗光源。随着半导体工业的发展，发光二极管(Light-emitting diode，LED)凭借其价格优势，在光动力疗法领域得到越来越多的应用，并且有许多研究表明，在实际光动力疗法中LED光源与激光具有近似的疗效[4]。最近几年，也有学者注意到室内日常灯光引起的光敏现象，有研究显示，与LED光源相比，家用光源在较高的光能剂量时也能产生显著的抑菌效果。这也表明使用家用光源可能是一种经济且治疗更方便的抗菌治疗方法[5]。

4 光动力疗法抗微生物治疗

4.1 光动力疗法在抗皮肤细菌感染中的应用 细菌性皮肤病是由细菌感染及细菌毒素侵袭导致的皮肤病变，引起的皮肤化脓性感染。在人医临床上最常见的皮肤致病菌为金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、A族链球菌。在小动物临床，细菌性皮肤病在犬猫中也较为常见。细菌性皮肤病对动物的损伤可涉及到表皮，甚至真皮或皮下深层组织结构，因此，可划分为表面、浅层和深层的细菌性皮肤病。在犬细菌性皮肤病病例中，常分离出的病原菌为伪中间葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、化脓性棒状杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌和奇异变形杆菌等。由于临床抗生素的滥用，导致细菌耐药问题越来越严重。目前已有不少研究者在探索光动力疗法对于皮肤致病细菌的抑制作用。近几年光动力疗法治疗细菌感染性皮肤病的相关研究显示，PDT对革兰阳性菌和革兰阴性菌均有不同程度的抗菌作用，在动物试验以及临床治疗中也表现出良好的疗效。

Bae等[6]使用LED蓝光，配合5-ALA，通过体外平板菌落计数、测定生长曲线以及荧光染色的方法，测定光动力疗法对6株临床分离的伪中间型葡萄球菌的抑菌效果。结果中比较有趣的一个发现，就是单纯ALA治疗无抑菌作用，而单纯蓝光治疗组显示随着光照时间增长细菌的存活率逐渐降低，在照射90 min后存活率降低到4.3%，说明LED蓝光对于伪中间型葡萄球菌就存在较强的杀伤作用；在配合光敏剂后，同等的照射时间细菌的存活率降低到2.14%。由于自制光源功率小，需要较长的治疗时间，因此也有学者使用商品化的光源进行试验。Schnedeker等[7]使用MR4 ACTIVet PRO的56.25、112.5 J/cm2和225 J/cm2三个剂量的光能，分别对甲氧西林敏感型伪中间型葡萄球菌(Meticillin-susceptibleStaphylococcuspseudintermedius，MSSP)、耐甲氧西林伪中间型葡萄球菌(Meticillin-resistantStaphylococcuspseudintermedius，MRSP)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Meticillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)进行照射，观察其抑菌作用。结果表明，蓝光对于MRSA的抑菌效果良好，在112.5 J/cm2的光能剂量下，即可达到100%的抑菌；但对于MSSP和MRSP的抑菌率仅为11.7%和21.2%。这与之前Bae等[6]的结果并不完全一致，笔者认为可能是不同的菌株造成的试验差异。

4.2 光动力疗法在抗真菌感染中的应用 皮肤癣菌是引起浅部真菌感染最常见的致病菌，在人医临床最常见的致病菌包括红色毛癣菌、须癣毛癣菌、絮状表皮癣菌等。而在小动物临床，皮肤癣菌感染也是最常见的感染性皮肤病之一，犬小孢子菌、须癣毛癣菌和石膏样小孢子菌是小动物临床上最常分离出的3种病原菌。皮肤癣菌侵袭皮肤后，真菌侵袭毛发与皮肤角蛋白，主要临床表现为脱毛、红斑、患部出现大量皮屑，以及不同程度的瘙痒，有一些病例还会出现真菌性结节或肉芽肿。对皮肤癣菌常用的治疗方法包括局部外用和/或全身系统用药。系统性用药通常包括唑类、多烯类、丙烯胺类等抗真菌药物。但由于皮肤癣菌感染的病程长，长期口服抗真菌药物存在肝损伤的风险。因此，在传统真菌疗法存在上述问题的情况下，国内外研究者也在不断探索新的治疗手段，利用光动力疗法治疗皮肤癣菌病就是其中之一。

Jochen等[8]使用姜黄素作为光敏剂，研究其对犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、指间毛癣菌、红色毛癣菌、絮状表皮癣菌、断发毛癣菌共6种真菌的体外抑菌作用，测定其光照前后的OD620，并制作生长曲线。这6种真菌作为亲人性、亲动物性和亲土壤性真菌的代表菌种，每个菌种各选取3个菌株作为平行对照。结果表明，单纯姜黄素作用对于石膏样小孢子菌在试验的最高浓度(5.4 mg/L)有轻微的抑制作用，而对于其他5种真菌均没有明显的抑制作用；而当姜黄素浓度为5.4 mg/L时，配合蓝光治疗对6种菌株均能产生明显的抑制作用。黄望强等[9]利用δ-氨基酮戊酸(ALA)测定光动力疗法对红色毛癣菌、须癣毛癣菌和白色念珠菌3株标准菌株的杀伤作用，结果表明，当ALA浓度为100 mmol/L时，抑菌率分别为(72.0±4.5)%、(76.4±2.0)%和(67.6±8.7)%；单纯光敏剂和单纯光照组对3株真菌生长无明显抑制作用。通过透射电镜观察ALA-PDT作用后的3株真菌，发现其细胞壁、细胞膜及细胞器均受到不同程度的破坏。

虽然有不少关于光动力疗法抗真菌的体外试验，但在动物体内以及临床直接进行试验的相关文献还比较少。Baltazar等[10]利用红色毛癣菌感染的小鼠模型，通过皮肤组织病理切片、活性氧测定等方法，检测甲苯胺蓝-红光的治疗效果，证明了使用LED红光和甲苯胺蓝的光动力疗法减少了小鼠皮肤内的真菌负载，并且ROS含量明显高于未治疗组，ROS在降低真菌生存能力和防止真菌损伤宿主组织方面具有重要作用。在人医临床将ALA-光动力疗法应用于趾甲甲癣患者，治愈率约为73.3%(n=22)[11]， 但在随访中也存在复发的问题。说明光动力疗法治疗皮肤癣菌虽然具有疗效好、起效快的优点，但是也存在易复发的问题，可能需要调整孵育时间、治疗周期加强治疗效果。

5 光动力疗法在小动物临床上的应用和展望

虽然光动力疗法在人医中已经广泛应用于许多疾病，但在小动物临床的研究还比较少。犬小孢子菌虽为犬猫临床皮肤癣菌感染中最常见的病原真菌，但对于其光动力研究也比较少，笔者目前仅看到Jochen等[8]使用姜黄素-PDT探究了其对犬小孢子菌的体外抑菌效果，但仍缺少体内试验证明其确切疗效。光动力疗法对于不同病原菌的疗效也不同，现有的体外试验虽显示有明显的抑菌杀菌作用，但由于体内外试验存在差异，因此仍需探索光动力疗法的具体流程。同时，为了增加光敏剂的渗透性以及皮肤粘附性来提高其杀菌效果，可能还需要使用凝胶、膏剂、透皮剂等药物，来减少治疗的次数。研究表明，Tris-EDTA能增加革兰阴性菌的细胞膜通透性，增加细菌对药物的吸收，从而达到更好的杀菌作用。因此其也可以作为一种抗菌辅助剂应用于光动力疗法中。

对于人兽共患的病原菌，使用新型的治疗方法，减少抗生素的使用，能有效防止耐药菌的产生以及二重感染等问题，具有积极的公共卫生意义。光动力疗法作为一种新兴的抗菌疗法，具有非特异性杀伤作用且与现有的抗菌药物作用机理不尽相同。虽然现在还有很多治疗条件需要摸索，但相信随着研究的深入，光动力疗法在临床的应用将逐渐被认可以推广，光动力疗法在抗感染治疗上必将发挥越来越大的作用。