布鲁氏菌弱毒活疫苗对绵羊全群免疫的探讨

王玉舜 ， 成 杰 ， 王家伟 ， 吴竹青 ， 刘建文 ， 吴清民

(1. 中国农业大学动物医学院 , 北京 海淀 100193 ； 2. 天津市北辰区养殖业发展服务中心 , 天津 北辰 300401 ； 3. 天津市动物疫病预防控制中心 , 天津 北辰 300401)

布鲁氏菌病(简称布病)是一种重要的动物源性人兽共患传染病。该病在全球170多个国家和地区流行并肆虐，仅人类每年新发病50万～70万例，直接损失超过50亿美元[1]。2000年后，我国新发布病人数直线上升，2015年官方报告近6万人。目前，我国每年新发病例上升趋势虽有下降，但该病在动物群内疫情蔓延仍未得到有效遏制，成为《国家中长期动物疫病防治规划(2012—2020年)》优先防治的最重要病种之一。因此，加强该病防控势在必行。

为了有效防控动物布病流行，世界卫生组织(WHO)颁布的理想动物布病疫苗标准[2]，其中最基本的要求是首先要能满足动物全群免疫的要求，在此基础上理想疫苗应具备高度免疫保护力、对人安全无害、不干扰检疫等特性。按该标准，国际参考疫苗—布鲁氏菌弱毒活疫苗(S19株和Rev.1株)虽具备优良的免疫原性，但因其接种孕畜导致流产，仅适于育成阶段的动物接种，不能满足全群免疫的基本要求[3]。我国常用的布鲁氏菌弱毒疫苗S2株、A19株和M5株，在布病防控历史上发挥过巨大贡献，但现有免疫程序未能覆盖不同日龄动物，距离理想布病疫苗要求相差较大，如A19株、S2株和M5株疫苗注射接种免疫原性高，但易引起孕母畜流产 ； S2株疫苗口服接种安全性良好，适合全群接种，但免疫原性较弱等。在现有条件下，按照理想疫苗标准选择优化疫苗接种对象和途径，力争通过疫苗接种阻断动物群内布病传播和蔓延，具有重要的实践意义。本试验将布鲁氏菌病活疫苗(S2株)、布鲁氏菌病活疫苗(M5株)和布鲁氏菌弱毒活疫苗(BA0711株)中试制品，以标注剂量分别接种怀孕中后期绵羊、1月龄内羔羊和1～2月龄羔羊，测定3种疫苗或制品对绵羊和羔羊的安全性和免疫适应性，为布病防控寻找一种合理的免疫程序提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 制品 布鲁氏菌病活疫苗(S2株)(批号：1711001)，中牧实业股份有限公司产品。布鲁氏菌病活疫苗(M5株)(批号：2017002)，天康生物股份有限公司产品。布鲁氏菌基因缺失弱毒疫苗(BA0711株)制品(批号：201702)，金河佑本生物制品有限公司中试产品。所用疫苗或制品均冻存于-20 ℃。

1.2 试剂 布鲁氏菌病虎红平板凝集试验抗原和试管凝集抗原，购自中国兽医药品监察所，批号分别为2016/10/03和2018/06/01。

1.3 试验动物 布病阴性健康易感绵羊150只，天津市郊区某羊场。

1.4 方法

1.4.1 动物选择及临床健康检查 试验开始前，分别对当地8个绵羊群进行临床健康检查、编号并采血分离血清，按《动物布鲁氏菌病诊断技术，GB/T18646—2018》规定的程序进行布鲁氏菌虎红平板凝集试验检测和结果判定。选取幼龄羔羊和怀孕85～100日龄健康母羊用于本试验。

1.4.2 动物接种 选取布病阴性1月龄内羔羊、1～2 月龄羔羊和85～100日龄绵羊各50只，分别随机分为5组，按表1程序和剂量分别接种3种疫苗或制品，每只接种1 mL。

表1 不同年龄段绵羊分组接种3种疫苗或制品的方法和剂量Table 1 Method and dose of three vaccines or products used for sheep of the different age groups

接种后连续观察60 d，记录接种羊体温、采食、精神以及母羊怀孕状况等临床反应。在试验观察过程中，用5%漂白粉消毒圈舍，1 次/d；发现母羊流产立即隔离病羊，将胎儿转入塑料袋进行无害化处理；污染的圈舍环境用5%漂白粉彻底消毒，试验羊只体表用0.1%新洁尔灭消毒。

1.4.3 血样采集 接种动物分别于第1周、第2周、第1个月、第2个月、第3个月、第4个月、第5个月、第6个月和第7个月采血分离血清，而对照动物则于第1个月、第3个月、第5个月和第7个月采血监测，按《动物布鲁氏菌病诊断技术GB/T18646—2018》操作程序及判断方法，测定布病抗体转阳状况及其抗体滴度，评价各组动物布病抗体产生和消长规律以及疫苗菌株潜在的水平传播状况。

2 结果

2.1 临床观察 与对照组相比，口服接种S2后的3年龄段试验羊无体温反应，食欲和精神状况无异常反应；但皮下接种S2株、M5株疫苗和BA0711株制品的3年龄段试验羊均出现2～3 d体温反应(升高0.5～1.0 ℃)，其食欲和精神状况却未见显著异常，由此也说明布鲁氏菌病疫苗接种幼龄羔羊安全良好。另外，截止至产羔结束，对照组、S2株口服组和BA0711株注射组孕羊未见流产和怀孕异常反应；而S2株和M5株疫苗皮下接种组试验羊分别于接种23 d和19 d流产各1只。因此，布鲁氏菌病疫苗接种应严格按照疫苗使用说明书操作，避免S2株和M5株疫苗接种孕羊。孕羊临床观察结果见表2。

表2 布鲁氏菌病疫苗经不同途径接种怀孕母羊的临床观察结果Table 2 Clinical observation of the pregnant ewes inoculated by the different routes of the Brucellosis vaccines

2.2 抗体产生及消长状况 3个年龄段绵羊经不同途径接种疫苗后，不同时间点采集血样，检测血清以虎红平板凝集试验出现“++”以上判为阳性，试管凝集试验抗体滴度≥1∶25判为阳性，测定并统计1月龄内羔羊、1～2月龄羔羊和怀孕母羊不同时间点抗体转阳结果分别见表3、表4和表5。3个年龄段对照组羊检测结果可见不同时间点羊只抗体均为阴性，表明疫苗菌株水平传播的概率极低。1月龄内羔羊口服接种S2株疫苗抗体阳转率最高达30%且抗体反应缓慢，90 d后完全消失；3种疫苗/制品皮下接种组羊抗体产生时间、阳转率和持续时间基本相似，最高阳转率80%，持续时间至少5个月，见表3。

表3 布病疫苗经不同途径接种1月龄羔羊抗体产生和消长状况Table 3 Antibody growth and decline of lambs aged in less than one month inoculated by the different routes of Brucellosis vaccines

1～2月龄羔羊口服接种S2株疫苗的抗体阳转水平和持续时间稍微高于1月龄内羔羊，但3种疫苗/制品皮下接种组羊抗体产生时间、阳转率和持续时间均显著高于1月龄内羔羊，7 d后阳转率即达80%以上，14 d达100%，且持续时间可达6个月，见表4。

表4 布病疫苗经不同途径接种1～2月龄羔羊抗体产生和消长状况Table 4 Antibody growth and decline of lambs aged 1-2 months inoculated by the different routes of Brucellosis vaccines

怀孕母羊口服接种S2株疫苗抗体阳转率最高达60%，接种14 d产生抗体且持续时间也相对较短；皮下接种组抗体产生时间、阳转率和持续时间较1～2月龄羔羊显著提高，7 d达90%以上阳性，14 d阳转率100%，持续时间达7个月以上，见表5。

综合以上抗体检测结果，从抗体产生时间、阳转率和持续时间看，布病疫苗口服接种显著低于注射接种；按照接种动物日龄分析，1～2月龄羔羊接种的反应性接近成年怀孕母羊，但1月龄内羔羊的抗体反应性很弱。

3 讨论

根据世界动物卫生组织资料和我国动物布病疫苗使用说明，国内外广泛应用的布鲁氏菌弱毒疫苗，因传统接种途径均会造成孕畜流产，其标签说明基本都是孕畜禁用。因此，尽管政府部门允许通过疫苗接种防控布病，但在一定地区或动物群中免疫动物群和非免疫动物群混养、临床感染动物和易感动物混养，防控措施收效大打折扣。由于疫苗保护率限制和免疫与自然感染难以鉴别，动物分娩、哺乳、配种和调运等环节监管困难，动物布病防控受到一定限制。针对这种局面，世界卫生组织(WHO)颁布理想布病疫苗标准时，重点强调了疫苗接种不同性别和所有年龄段动物的基本要求。然而，从本试验结果可以看出，S2株疫苗口服接种或BA0711株制品皮下接种对孕羊的安全性良好，可以满足成年动物布病防控需求。此外，通过避开季节性发情动物期，或改变免疫途径和剂量，S2株和M5株等疫苗注射接种尽管还存在一定的孕畜流产风险，但若能严格控制使用程序和方法，也可在一定程度上满足成年动物的接种要求[4]。因此，预防孕羊流产的疫苗及其接种程序具有可行性。

全群接种的基本要求是所有年龄动物都接种。有关报道显示，年龄越小，动物对布鲁氏菌感染的先天性抵抗力越强[5]。另外，根据国内外疫苗免疫程序，除了S2疫苗规定无论年龄大小均可口服接种外，其余疫苗的最小接种日龄未做具体规定，且规定过于笼统，那么究竟布鲁氏菌弱毒疫苗对绵羊的最小可接种日龄是多大才能激发其免疫反应并尽量满足全群接种的要求？由于相关文献未能系统明确布病疫苗对不同日龄动物接种抗体的反应程度，本试验通过3种疫苗(制品)按要求途径接种不同日龄绵羊的反应性结果显示，1月龄内羔羊对布病疫苗接种的反应性很小，抗体呈现一过性反应；而1～2月龄羔羊对疫苗接种的反应性(阳性率和抗体滴度)接近成年羊，但持续时间比成年羊稍短。基于幼龄羔羊对布病疫苗接种反应性微弱，因此建议在大规模免疫防控时，羊群内2月龄以上所有羊只全部接种，以阻断布病在群内传播。然而，由于初生犊牛感染布鲁氏菌抗体消失很快却存在体内带菌的现象[6]，以及布鲁氏菌以细胞免疫为主的事实[7]。出生后幼龄动物的免疫具体时间尚待进一步研究确定。

综上所述，动物布病防控实践中对疫苗免疫防控的理想要求是在一定地区或牧场内，易感动物无论年龄大小，群内动物全群接种。通过疫苗选择和控制免疫程序及接种方法避免孕畜流产。鉴于1月龄内羔羊对布病疫苗接种反应微弱，抗体反应呈一过性，建议全群接种时先避开2月龄内幼羔，待2月龄以后补免，以建立全群布病免疫力。