雷公藤红素对胃癌细胞体外生长活力及增殖、凋亡基因表达的调节作用

李佳 杨晓丹 刘永叶

胃癌是我国发病率最高的消化道恶性肿瘤,由其引起的死亡率居所有恶性肿瘤的第四位。手术切除是目前胃癌的首选治疗手段,联合术后辅助化疗虽然能够延长患者的生存时间,但患者在术后发生肿瘤复发及转移的几率仍高达80%,5 年生存率也仅为30%～40%［1,2］。近年来,中药在恶性肿瘤治疗中的价值受到了越来越高的重视,多种中药具有高效低毒的特点。雷公藤红素(celastrol,Cel)是在中药雷公藤中提取得到的天然活性物,属于醌甲基三萜类化合物,具有广泛的抗肿瘤活性［3］。已有研究报道,雷公藤红素对卵巢癌细胞、结肠癌细胞的体外生长具有抑制作用［4,5］,但关于该药物在胃癌治疗中的应用价值尚不明确。为了明确雷公藤红素用于胃癌治疗的潜在价值,本研究具体分析了雷公藤红素对胃癌细胞体外生长活力及增殖、凋亡基因表达的调节作用,具体如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 胃癌细胞株BGC823 购自ATCC 公司,DMEM 购自Gibco 公司,FBS 购自杭州四季青公司,MTS 细胞生长活力检测试剂盒购自Promega 公司,mRNA 表达检测试剂盒购自北京康为世纪公司。

1.2 实验仪器 细胞培养箱及离心机购自Thermo 公司,酶标仪及PCR 仪均购自Bio-rad 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞分组及培养 BGC823 细胞用含有10%FBS 的DMEM 进行常规培养,每2 天更换1 次培养液,待细胞密度生长至80%左右时用胰蛋白酶进行消化、传代；取传代后的第6～10 代细胞进行分组,根据后期处理不同分为空白对照组(用不含FBS 的DMEM处理)和0.5 μmol/L Cel组(用含有0.5 μmol/L雷公藤红素的DMEM 处理)、1.0 μmol/L Cel 组(用含有1.0 μmol/L雷公藤红素的DMEM 处理)、1.5 μmol/L Cel 组(用含有1.5 μmol/L 雷公藤红素的DMEM 处理)、2.0 μmol/L Cel 组(用含有2.0 μmol/L 雷公藤红素的DMEM 处理),各6 株。

1.3.2 细胞生长活力的测定 分组的细胞接种在96 孔培养板内,用不同条件处理24 h 后在每个培养孔内加入20 μl MTS 试剂盒检测液,在培养箱中继续培养4 h,取出培养板并震荡,而后在酶标仪上读取450 nm波长处的吸光值,以吸光值作为细胞生长活力值。

1.3.3 基因mRNA 表达水平的测定 分组的细胞接种在6 孔培养板内,用不同条件处理24 h 后弃去培养孔内的培养液,用超纯RNA 提取试剂盒分离得到细胞内的RNA,用SuperRTcDNA 第一链合成试剂盒将细胞内的RNA 反转录为cDNA,用UltraSYBR Mixture试剂盒对基因cyclinD1、PI3K、mTOR、β-catenin、p16、PTEN、GSK-3β、Bax、FASL、FAS、Caspase-3、Bcl-2、Livin、Survivin 进行扩增,根据扩增曲线计算mRNA 相对表达水平。

1.4 统计学方法 采用SPSS23.0 统计学软件对数据进行处理。计量资料以均数±标准差()表示,采用t 检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞生长活力比较 空白对照组及0.5、1.0、1.5、2.0 μmol/L Cel 组的细胞生长活力分别为(1.36±0.22)、(1.02±0.16)、(0.83±0.16)、(0.70±0.09)、(0.56±0.08),0.5、1.0、1.5、2.0 μmol/L Cel 组的细胞生长活力均明显低于空白对照组,2.0 μmol/L Cel 组的细胞生长活力均明显低于0.5、1.0、1.5 μmol/L Cel 组,差异均有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 各组促增殖基因表达及增殖抑制基因表达水平比较 0.5、1.0、1.5、2.0 μmol/L Cel 组中cyclinD1、PI3K、mTOR、β-catenin 的mRNA 表达水平均明显低于空白对照组,p16、PTEN、GSK-3β 的mRNA 表达水平均明显高于空白对照组,差异具有统计学意义(P＜0.05)；0.5、1.0、1.5、2.0 μmol/L Cel 组 中cyclinD1、PI3K、mTOR、β-catenin 的mRNA 表达水平均呈降低趋势,p16、PTEN、GSK-3β 的mRNA 表达水平均呈升高趋势,各组间两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表1,表2。

2.3 各组促凋亡基因表达及凋亡抑制基因表达水平比较 0.5、1.0、1.5、2.0 μmol/L Cel 组中Bax、FASL、FAS、Caspase-3 的mRNA 表达水平均明显高于空白对照组,Bcl-2、Livin、Survivin 的mRNA 表达水平均明显低于空白对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05)；0.5、1.0、1.5、2.0 μmol/L Cel 组中Bcl-2、Livin、Survivinn的mRNA 表达水平均呈降低趋势,Bax、FASL、FAS、Caspase-3 的mRNA 表达水平均呈升高趋势,各组间两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表3,表4。

表1 各组促增殖基因表达水平比较()

表1 各组促增殖基因表达水平比较()

注：与空白对照组比较,aP＜0.05；与0.5 μmol/L Cel 组比较,bP＜0.05；与1.0 μmol/L Cel 组比较,cP＜0.05；与1.5 μmol/L Cel组比较,dP＜0.05

表2 各组增殖抑制基因表达水平比较()

表2 各组增殖抑制基因表达水平比较()

注：与空白对照组比较,aP＜0.05；与0.5 μmol/LCel 组比较,bP＜0.05；与1.0 μmol/L Cel 组比较,cP＜0.05；与1.5 μmol/L Cel组比较,dP＜0.05

表3 各组促凋亡基因表达水平比较()

表3 各组促凋亡基因表达水平比较()

注：与空白对照组比较,aP＜0.05；与0.5 μmol/LCel 组比较,bP＜0.05；与1.0 μmol/L Cel 组比较,cP＜0.05；与1.5 μmol/L Cel组比较,dP＜0.05

表4 各组凋亡抑制基因表达水平比较()

表4 各组凋亡抑制基因表达水平比较()

注：与空白对照组比较,aP＜0.05；与0.5 μmol/LCel 组比较,bP＜0.05；与1.0 μmol/L Cel 组比较,cP＜0.05；与1.5 μmol/L Cel组比较,dP＜0.05

3 讨论

胃癌的发病率高,但预后不良,5 年生存率低,手术切除联合术后辅助化疗能够使患者的生存时间延长,但整体疗效仍有极大改进空间。近年来,中药的抗肿瘤作用受到了越来越多的关注,雷公藤红素是在中药雷公藤中提取得到的抗肿瘤活性成分,已经在卵巢癌、结肠癌相关的细胞研究中被证实能够抑制癌细胞的生长［4,5］。为了明确雷公藤红素用于胃癌治疗的价值,本研究离体培养了胃癌BGC823 细胞株,并用不同剂量的雷公藤红素进行处理,分析雷公藤红素处理后的细胞生长活力,提示：不同剂量雷公藤红素处理后细胞的生长活力均明显下降,且雷公藤红素的剂量越大,生长活力受抑制越明显。这一结果表明雷公藤红素对胃癌细胞的生长具有显著的抑制作用,进而提示雷公藤红素具有治疗胃癌的潜在价值。

癌细胞的生长过程与细胞增殖、凋亡等生物学行为密切相关,当增殖基因、凋亡基因表达发生改变时,细胞增殖和凋亡行为发生相应变化并对细胞的生长产生影响。胃癌病灶内与癌细胞生长相关的基因变化包括促增殖基因cyclinD1、PI3K、mTOR、β-catenin 及凋亡抑制基因Bcl-2、Livin、Survivin 的高表达［6-8］,增殖抑制基因p16、PTEN、GSK-3β 及促凋亡基因Bax、FASL、FAS、Caspase-3 的低表达［9,10］,上述基因已经被证实在胃癌病灶内发生了相应的变化。在明确雷公藤红素对胃癌细胞生长的抑制作用后,本研究进一步分析了雷公藤红素对胃癌细胞内增殖基因、凋亡基因的调节作用,旨在明确雷公藤红素发挥生长抑制作用的分子机制。

促增殖基因和增殖抑制基因通过调节细胞增殖来影响细胞生长过程。促增殖基因cyclinD1 的编码产物能够与相应激酶结合并促进细胞周期发展,有利于增强细胞的生长活力；PI3K、mTOR、β-catenin 是cyclinD1 上游的调节基因,PI3K 活化后能够使mTOR激活、Wnt 通路活化,则能使β-catenin 激活,mTOR和β-catenin 激活后能够进入细胞核并启动cyclinD1的表达。增殖抑制基因p16 能够直接拮抗cyclinD1的活力并阻碍细胞周期,降低细胞生长活力；PTEN和GSK-3β 分别拮抗PI3K 及β-catenin,PTEN 能够使PI3K 发生去磷酸化并阻碍由其介导的细胞生长,GSK-3β 能够水解β-catenin 并阻碍由其介导的细胞生长。本研究对增殖基因的分析发现：不同剂量雷公藤红素处理后细胞中cyclinD1、PI3K、mTOR、β-catenin的mRNA 表达水平降低,p16、PTEN、GSK-3β 的mRNA 表达水平均增加,且雷公藤红素剂量越大,基因表达的趋势越明显。这一结果表明雷公藤红素能够使胃癌细胞中促增殖基因表达减少、增殖抑制基因表达增加,进而通过增殖抑制活性来起到生长抑制作用。

促凋亡基因和凋亡抑制基因通过调节细胞凋亡来影响细胞生长过程。Caspase-3 是细胞凋亡的执行分子,上游线粒体途径和死亡受体途径能够通过Caspase-7、Caspase-8 及Caspase-9 来使Caspase-3 发生活化,进而直接引起细胞凋亡；Bax是线粒体凋亡途径的促进分子,FAS/FASL 则是死亡受体凋亡途径的促进分子,通过介导促凋亡活性来抑制细胞生长。Bcl-2、Livin、Survivin是细胞凋亡的抑制分子,Bcl-2 通过拮抗Bax 来起到凋亡抑制作用,Livin、Survivin 则直接通过拮抗多种Caspase 的激活来抑制凋亡。本研究对凋亡基因的分析发现：不同剂量雷公藤红素处理后细胞中Bax、FASL、FAS、Caspase-3 的mRNA 表达水平增加,Bcl-2、Livin、Survivin 的mRNA 表达水平均减少,且雷公藤红素剂量越大,基因表达的趋势越明显。这一结果表明雷公藤红素能够使胃癌细胞中促凋亡基因表达增加、凋亡抑制基因表达减少,进而通过促凋亡活性来起到生长抑制作用。

综上所述,雷公藤红素对胃癌细胞体外生长活力具有抑制作用,调节增殖及凋亡基因表达是雷公藤红素发挥生长抑制作用的分子机制。本研究的结论均来自细胞实验,今后可进一步在荷瘤鼠模型中验证雷公藤红素对胃癌病灶生长的抑制作用。