谷氨酸-谷氨酰胺循环异常与孤独症谱系障碍研究进展

袁启锋, 姚宝珍

武汉大学人民医院儿科, 武汉 430060

孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder，ASD)是一种多病因神经发育性疾病，人群患病率约为1%，其中男性患病率约为1∶42，是女性患病率的4倍[1]。其临床核心症状为社会交往障碍、重复刻板样动作和狭窄兴趣，除核心症状外，ASD患者还常表现有焦虑、抑郁、多动、冲动、易激惹、智力障碍、注意力缺陷、睡眠障碍、癫痫、便秘等伴随症状[2]。自1940s首次描述ASD[3]，科学界对其病因进行了广泛探讨，包括炎症、自身免疫、基因异常等，但具体发病机制仍未明了。

在哺乳动物中枢神经系统(central nervous system，CNS)中，谷氨酸是最主要的兴奋性神经递质，也是一种潜在的神经毒素，其引起的兴奋毒性可能导致神经细胞的死亡。为了保持突触传递的敏感性，谷氨酸必须被及时清除，其中，星形胶质细胞的摄取是保持胞外谷氨酸浓度稳定的最主要途径[4]。星形胶质细胞和神经元之间谷氨酸-谷氨酰胺的代谢偶联(图1)，可以防止过量的谷氨酸扩散到周边的神经元上，进而避免了神经元的过度兴奋，对神经元起到保护作用。谷氨酸能神经元是哺乳动物大脑皮层最主要的神经元。在谷氨酸能神经元中，谷氨酰胺(glutamine，Gln)经谷氨酰胺酶(glutaminase，GLS)催化为谷氨酸(glutamate，Glu)，Glu与N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR)、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(α-amino-3-hydroxy5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor，AMPAR)、红藻氨酸受体(kainate receptor，KAR)、代谢性谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptors，mGluRs)结合，形成兴奋性电位。星形胶质细胞可通过膜上谷氨酸转运体(glutamate transporter, GLT)摄取突触间隙Glu，在谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)作用下转化为Gln，后者被星形胶质细胞释放，可再次进入Glu能神经元或者γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)能神经元。在GABA能神经元，Glu被谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase，GAD)催化为GABA，与Glu能神经元相类似，GABA与GABA受体结合，产生抑制性电位，被星形胶质细胞经GABA转氨酶(GABA transporter，GAT)摄取的GABA通过三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle，TAC)，重新转化为Glu和Gln，从而被再次利用[5]。一系列研究表明，Glu与GABA在ASD患者不同脑区表达水平不同[6-8]，提示谷氨酸-谷氨酰胺循环异常可能为ASD发生的核心机制。因此，本文围绕谷氨酸-谷氨酰胺循环与ASD的关系进行综述，重点探讨炎症、自身免疫、基因异常等ASD经典致病因素与该循环异常之间的联系，以期为孤独症谱系障碍分型和治疗提供一种新思路。

图1 谷氨酸-谷氨酰胺循环模式Fig.1 Glutamate-glutamine cycle mode

1 谷氨酸-谷氨酰胺循环异常与ASD

1.1 Glu、GABA水平与ASD

当前，关于ASD患者Glu、GABA水平的研究结论并不一致(表1)，这可能是由于研究对象在年龄、性别、受试者数量等因素方面存在较大的差异且所取的生物学样本不同[13]。后续研究可以通过标准化这些因素来改进，并且利用Glu/GABA比值来代替单个氨基酸水平，以更好地反映神经兴奋/抑制平衡。由于Glu、GABA在ASD发病机制和治疗中的潜在作用，监测其在体液乃至唾液、尿液和粪便中的浓度变化对ASD患者的早期诊断和干预也很重要;此外，有研究提示GABA可能是一种灵敏度和特异度均较高的ASD血清标志物[14]。

1.2 NMDAR与ASD

NMDAR是一种配体门控兴奋性离子通道受体，在神经元兴奋性毒性和突触可塑性方面发挥重要作用。NMDAR广泛分布于大脑，由GluNR1～GluNR3 3个亚基构成：GluNR1含甘氨酸结合位点；GluNR2有A、B、C、D 4种亚型，含Glu结合位点；部分NMDAR还含有GluNR3亚基，可抑制该受体功能。静息状态时，NMDAR钙离子(Ca2+)通道由水合镁离子(Mg2+)堵塞。当突触前膜释放Glu等神经递质，激活AMPAR等受体，突触后膜去极化，Mg2+被移除，此时甘氨酸结合GluNR1亚基与Glu结合GluNR2亚基共激动NMDAR，Ca2+通道开放，Ca2+进入神经元细胞质。当突触间隙Glu浓度异常升高，NMDAR过度激活时，神经元胞质内钙超载，活化相关代谢酶、生成氧自由基、破坏细胞能量产生，进而损伤神经元[15]。NMDAR过度激活所导致的神经元兴奋性毒性损伤可能与ASD发病相关。研究发现，ASD患者血清甘氨酸浓度更高[16]，同样，丙戊酸(valproic acid，VPA)诱导的ASD模型小鼠前额叶皮层GluNR2B亚基水平也较正常组高[17]，提示ASD患者NMDAR功能增强。而使用NMDAR拮抗剂MK-801(出生后6～10 d给药)，可改善VPA模型ASD鼠社会交往障碍和重复刻板样动作[18]，但MK-801(0.03 mg·kg-1)也会损害正常小鼠社会交往功能[19]，这可能与MK-801剂量有关，剂量不同，它的生物效应可能截然相反[20]。D-环丝氨酸，作为甘氨酸结合位点相关的NMDAR部分激动剂，可作用于NMDAR，进而促进AMPAR移除来改善ASD模型鼠(出生后28 d给药)社会交往障碍，且不同于Glu直接激活NMDAR，D-环丝氨酸并不会导致兴奋性神经毒性[21]。NMDAR的激活需AMPAR参与，故D-环丝氨酸最终可能通过降低VPA暴露后代的NMDAR功能来改善ASD症状，当然这需要进一步试验来验证。此外，ASD鼠NMDAR功能可能与小鼠年龄密切相关。Shank2-/-小鼠是经典的ASD模型，研究发现，这种小鼠在出生早期(出生后15 d内)表现为NMDAR功能亢进，后期则表现为NMDAR功能减退，早期使用NMDAR拮抗剂——美金刚，可有效缓解小鼠社会交往障碍，而早期使用D-环丝氨酸或后期使用美金刚则均无明显效果[22]。那么，VPA诱导的ASD模型鼠甚至临床ASD患者NMDAR功能是否随年龄有这种类似转变，仍需进一步深入探究。

表1 谷氨酸-谷氨酰胺循环异常与ASD发病相关研究Table 1 Study on the relationship between abnormal glutamate-glutamine cycle and ASD

2 炎症与ASD

炎症是机体的一种固有免疫方式，正常机体促炎细胞因子/抗炎细胞因子处于平衡状态。肥胖与促炎细胞因子/抗炎细胞因子失衡相关。值得注意的是，与正常人群相比，ASD患者常有肥胖表现[23]。提示ASD可能与炎症相关[24-26]。进一步研究发现，肿瘤坏死因子-ɑ(tumor necrosis factor-ɑ，TNF-ɑ)mRNA表达水平与ASD患者社会行为异常有关，与患者其他核心症状相关性则未得到证实[27]。

炎症可通过影响谷氨酸-谷氨酰胺循环导致ASD发生(图2)。在ASD动物模型中，促炎细胞因子/抗炎细胞因子失衡与谷氨酸-谷氨酰胺循环异常并存[25]。星形胶质细胞在谷氨酸-谷氨酰胺循环中具有重要作用，神经炎症可致GLT-1表达上调和GS表达下调，进而影响星形胶质细胞的数量和功能，导致其对Glu摄取能力下降，过度激活NMDAR，造成神经元兴奋性毒性损伤[28-29]。为探究ASD患者神经炎症与谷氨酸-谷氨酰胺循环异常之间的因果关系，El-Ansary等[30]对20名ASD患儿血清样本进行多元回归分析，认为ASD患儿血清Glu升高87%归因于神经炎症。进一步研究还发现，神经炎症可激活犬尿氨酸途径(kynurenine pathway，KP)，该途径代谢产物喹啉酸过度激活NMDAR导致ASD发生[31]。

图2 炎症通过影响谷氨酸-谷氨酰胺循环导致ASD发生Fig.2 Inflammation leads to ASD by affecting glutamate-glutamine cycle

3 自身免疫性抗体与ASD

自身免疫性抗体由B细胞合成，CD19是B细胞表面重要膜抗原。对ASD患者外周血流式细胞分型，可发现CD19阳性细胞计数较正常人群高[32]。部分ASD患者发病与自身免疫性抗体相关，例如：1型糖尿病绝大多数为自身免疫性疾病，母亲患1型糖尿病，其子女ASD风险也更高[33]。但Connery等[34]对82名ASD患儿自身免疫性脑炎相关的多种抗体进行检测，发现NMDAR血清抗体均阴性，仅有5%患儿GAD65抗体阳性。当然，抗NMDAR抗体脑炎患儿可表现为ASD样症状[35]，说明该抗体可能与ASD发病相关，但并不是由于抗体直接影响谷氨酸-谷氨酰胺循环所致，因为NMDAR抗体阳性的ASD患儿突触上NMDAR并未被破环[36]。自身免疫抗体可能是在大脑形成免疫复合物介导炎症，从而间接导致该循环异常[37]。

4 基因异常与ASD

多种ASD相关基因与谷氨酸-谷氨酰胺循环异常相关，且ASD严重程度与该循环存在遗传关联[38]。NMDAR基因表达异常会导致ASD发生，其离子通道开放需同时激活突触前膜和突触后膜，这种独特开放机制使NMDAR对于突触可塑性具有重要影响。长时程抑制 (long-term depression, LTD)和长时程增强 (long-term potentiation, LTP)是突触可塑性的两种关键形式。

NMDAR轻度去极化时，Ca2+少量进入突触后神经元，突触后膜AMPAR被移除且去磷酸化，LTD发生。Neuroligin基因家族编码突触后细胞黏附分子，对突触的发育和成熟有重要作用。Neuroligin1是该家族成员之一，Neuroligin1基因缺失杂合子小鼠海马区NMDAR介导的LTD减弱，并表现为ASD样症状[39]。同样，该家族另一基因，R451C-neuroligin3发生突变，也会减弱LTD，导致ASD发生[40]。但Lee等[41]提到，ASD相关基因突变可能是减弱mGluR介导的LTD，而非NMDAR介导的LTD。

LTP是突触可塑性的另一种形式。当NMDAR被激活，Ca2+大量进入突触后神经元，非突触AMPAR插入突触后膜且AMPAR被磷酸化，LTP发生。ASD相关基因突变影响NMDAR介导的LTP也可能是疾病发生的一种机制。Rac1是一种小G蛋白，具有GTP酶活性，当其被鸟嘌呤核苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factor，GEF)激活，与GTP结合时，便能促进肌动蛋白聚合。Dock4属于GEF成员，由DOCK4基因编码，可激活Rac1，DOCK4基因敲除小鼠表现为ASD样行为，且海马CA1区NMDAR密度减少，NMDAR介导的LTP也被抑制，而药物激活NMDAR可减轻这些小鼠的社会认知障碍[42]。总之，ASD相关基因表达异常可能影响谷氨酸-谷氨酰胺循环，并进一步影响突触可塑性，从而导致疾病的发生。

5 展望

ASD临床表现不尽相同，病因也是复杂多样，导致该疾病诊断和治疗难度颇大，探究众多病因的内在联系，明确ASD发病核心机制，对于疾病的研究显得极其重要。谷氨酸-谷氨酰胺循环异常可能是ASD的核心发病机制，炎症、自身免疫性抗体和ASD相关基因异常等经典病因均可能通过影响该循环，导致疾病的发生。当前，谷氨酸-谷氨酰胺循环异常具体如何导致ASD发生，相关研究结论并不一致。后续临床研究需要尽可能扩大样本量，且研究对象尽可能同质。本文为简化ASD病因及分型提供了一种新思路，即ASD发病相关病因较多，但它们均可能是通过影响谷氨酸-谷氨酰胺循环导致疾病的发生，那么，未来或许可针对该循环这一共同靶点对ASD进行有效治疗。