十溴联苯醚(BDE-209)短期暴露对成年期小鼠的免疫毒性研究

廖桃桃, 汤俊杰, 史潇翔, 张伟杰, 茆广华*, 吴向阳*

1.江苏大学环境与安全工程学院, 江苏 镇江 212013；2.江苏大学食品与生物工程学院, 江苏 镇江 212013

多溴联苯醚(polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)是一类典型的持久性有机污染物，作为常用的阻燃剂广泛应用于建筑、塑料、纺织和电子产品等行业[1-2]。2,2′,3,3′,4,4′,5,5′,6,6′-十溴联苯醚(BDE-209)是PBDEs家族中使用量最大的一种，所占比例超过82%[3]。2017年《斯德哥尔摩公约》将BDE-209列为持久性有机污染物[4]，但其仍在各种环境介质(灰尘、空气、水体)、食品和人体样本中普遍检出[5-10]。研究表明，BDE-209具有生物蓄积性，其毒性效应和潜在的健康风险逐渐引起人们的广泛关注。目前，针对BDE-209毒性效应的研究表明，BDE-209可引起动物和人体的各种系统毒性，包括发育神经、生殖和内分泌系统毒性等[11-13]。BDE-209对免疫系统的毒性也有相关报道。Feng等[14]发现，小鼠口服800 mg·kg-1BDE-209两年可引起多种器官的组织病理学改变。Zeng等[15]研究表明，BDE-209(口服800 mg·kg-1，超过7个月)可减少白细胞数量、抑制CD8 T细胞增殖和细胞因子的产生，从而引起免疫毒性。然而，这些从不同角度评估免疫毒性的研究缺乏系统性及多指标的综合分析评价，且关于机体短期暴露于BDE-209是否可自行恢复的研究鲜见报道。

综合生物标志物响应(integrated biomarker responses, IBR)是一种可通过简单计算将多种生物标志物转化为单个指标的综合分析方法[16]。通过综合分析，IBR可避免由于不同生物标志物的不同步而导致的评估结果偏差。过去几十年，IBR被广泛应用于生态和医疗研究领域[17-19]。现今，IBR也逐渐应用于毒理学领域，但主要集中于水生毒理学研究，缺乏在啮齿动物毒理学领域的应用[20-22]。因此，本研究通过建立成年期雌性Balb/c小鼠BDE-209暴露模型，考察其对脏器指数、免疫球蛋白、淋巴细胞增殖、脂质过氧化等免疫指标的影响，并用IBR结合其他分析方法对研究结果进行综合性评估，通过综合性评价指标揭示短期BDE-209暴露的免疫毒性及机体的自体修复情况，该研究可为BDE-209的免疫毒性评估提供基础数据，对人类健康具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1药品与试剂 BDE-209(CAS No.1163-19-5)购自上海甄淮生物科技有限公司(以大豆油为溶剂，配置成浓度梯度为0.6、6和60 mg·mL-1的BDE-209大豆油溶液)；胎牛血清(FBS)和悬浮细胞1640 培养基(RPMI 1640)购自美国GIBCO公司；脂多糖(LPS)、刀豆蛋白A(ConA)、噻唑兰(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司；IFN-γ、IL-4、IgG酶联免疫试剂盒购自合肥博美生物技术有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；RNA提取试剂盒购自Takara公司；cDNA反转录试剂盒和DNA扩增试剂盒购自罗氏公司。

1.1.2动物与分组 清洁级8周龄 Balb/c 雌性小鼠80只，体重(18±2)g，购自江苏大学动物中心，于实验前检疫3 d，饲养温度(23±1)℃，湿度60%±5%。实验动物随机分组，每组20只，于产后(postnatal day，PND)56～76 d暴露于BDE-209。实验设对照组(玉米油)、BDE-209高剂量组(400 mg·mL-1BDE-209)、BDE-209中剂量组(40 mg·mL-1BDE-209)和BDE-209低剂量组(4 mg·mL-1BDE-209)，灌胃量为0.2 mL·30 g-1·d-1，每天1次，连续给药21 d。分别于给药结束后的第1 d(PND77)和第21 d(PND98)进行相关指标的测定。

1.2 方法

1.2.1成年期BDE-209暴露对小鼠血常规指标的影响 末次给药后第1 d 和第21 d，取小鼠眼球血于抗凝管中混匀，用于白细胞、淋巴细胞比率、红细胞及血小板分析。

1.2.2成年期BDE-209暴露对小鼠脏器指数的影响 末次给药后第1 d 和第21 d，脱颈处死。取出脾脏和胸腺并称重记录，按照公式计算脏器指数。

脏器指数(mg·g-1)=脏器重量(mg)/体重(g)

1.2.3成年期BDE-209暴露对小鼠血清IgG的影响 末次给药后第1 d和第21 d，小鼠眼后静脉丛取血，3 000 r·min-1离心10 min，取上层血清，采用酶联免疫法测定血清中IgG的含量。

1.2.4成年期BDE-209暴露对小鼠淋巴细胞增殖的影响 脾细胞悬液的制备参考Li等[23]的方法。调整脾细胞悬液浓度为5×106个·mL-1，接种于96孔板，100 μL·孔-1。分别向每孔中加入ConA液(10 μg·mL-1，100 μL)或LPS液(20 μg·mL-1，100 μL)，对照孔加入等量培养液，每组设10个复孔。于37 ℃，5% CO2细胞培养箱中培养72 h后，采用MTT法于570 nm处测定其OD值。

1.2.5成年期BDE-209暴露对小鼠淋巴细胞分泌细胞因子的影响 按照1.2.4的方法制备脾细胞悬液，接种于24孔板，200 μL·孔-1，培养48 h后，1 000 r·min-1离心10 min，取上清液，采用酶联免疫法测定IFN-γ和IL-4的含量。

1.2.6成年期BDE-209暴露对小鼠脂质过氧化的影响 末次给药后第1 d和第21 d，分别取脾脏和胸腺各200 mg置于10 mL离心管中，加入适量的生理盐水，制成10%的组织匀浆液，3 000 r·min-1离心10 min后，取上清液，根据试剂盒说明测定MDA和SOD的含量。

1.2.7成年期BDE-209暴露对小鼠脾脏IFN-γ和IL-4 mRNA表达的影响 末次给药后第1 d和第21 d，小鼠脱颈处死，取其脾脏，去除结缔和脂肪组织后，按照Trizol试剂盒要求提取总RNA，Nanodrop2000测定总RNA浓度。按照Takara试剂盒要求将RNA反转录为cDNA，-80 ℃保存。以cDNA为模板进行PCR扩增反应，用LightCycler 96荧光定量PCR仪进行荧光定量分析。

表1 qPCR研究中引物序列Table 1 Primers sequences in the qPCR study

1.3 IBR计算

1.4 数据处理

数据分析采用SPSS16.0统计软件，组间差异采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，结果用平均值±标准差(X±SD)表示，采用Turkey检验方法用于实验中各暴露组与对照组之间差异的显著性比较，P<0.05表示暴露组与对照组之间有显著性差异。析因分析、主成分分析结合IBR用于指标的综合分析，其中析因分析中P<0.05具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 成年期BDE-209暴露对小鼠血常规指标的影响

如表2所示，在PND77时，与空白对照组相比，小鼠白细胞数量及淋巴细胞比率均呈下降趋势，并在中高剂量组具有统计学差异(P<0.05)。PND98时，BDE-209暴露引起的血常规指标异常均得到恢复，且与对照组相比无显著差异，提示小鼠在切断暴露源后可得到一定程度的自我修复。

2.2 成年期BDE-209暴露对小鼠脏器指数的影响

如表3所示，与空白对照组相比较，PND77时各暴露组小鼠的脾脏和胸腺指数均呈下降趋势，且在中高剂量组具有统计学差异(P< 0.05或P< 0.01)。停止暴露21 d后(即PND98时)，各暴露组脏器指数均得到一定程度的恢复且与对照组无显著差异(P>0.05)。可见，中、高剂量BDE-209暴露可引起小鼠免疫器官的萎缩，但该毒性效应可通过机体自我修复得到改善。

2.3 成年期BDE-209暴露对小鼠血清IgG的影响

如图1所示，短期低、中剂量BDE-209暴露可显著增加小鼠血清IgG含量(P< 0.01)，停药21 d各剂量组IgG含量与空白对照组无显著差异，提示该免疫刺激作用可在暴露源清除后得到改善。

表2 成年期BDE-209暴露对小鼠脏器指数的影响Table 2 Effect of BDE-209 exposure on organ index of adult mice

表3 成年期BDE-209暴露对小鼠脏器指数的影响Table 3 Effect of BDE-209 exposure on organ index of adult mice

注：**表示与空白对照组相比，差异在P<0.01水平上具有统计学意义。图1 成年期BDE-209暴露对小鼠血清IgG的影响Fig.1 Effect of BDE-209 exposure on IgG secretion from serum in adulthood mice

2.4 成年期BDE-209暴露对小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响

由图2可知，PND77时，BDE-209可不同程度抑制ConA和LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖，与对照组相比，各暴露组均具有显著的抑制作用(P<0.01)。PND98时，BDE-209暴露所致的脾淋巴细胞增殖能力降低得到改善且与对照组相比无显著差异，表明BDE-209暴露所致的成年期小鼠细胞免疫损伤可随着暴露源清除得到改善。

2.5 成年期BDE-209暴露对小鼠淋巴细胞分泌细胞因子的影响

由图3可知，BDE-209暴露21 d可抑制小鼠淋巴细胞IFN-γ的分泌，促进IL-4的分泌，且高剂量组与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。暴露结束21 d后，二者均得到改善，但与对照组相比，高剂量组IL-4的分泌量与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)，提示BDE-209暴露对IFN-γ和IL-4的影响可在暴露源清除后得到一定程度的恢复。

2.6 成年期BDE-209暴露对小鼠脂质过氧化的影响

由图4可知，PND77时，BDE-209可显著增加脾脏和胸腺组织中MDA含量，降低SOD活性(脾脏40 mg·kg-1和400 mg·kg-1，P<0.01；胸腺，400 mg·kg-1，P<0.01)。PND98时，高剂量组可显著增加组织MDA含量(P<0.01)，并显著降低胸腺SOD活性(P<0.01)，表明BDE-209暴露对小鼠脂质过氧化的影响较难在暴露源清除后得到恢复。

注：**表示与空白对照组相比，差异在P<0.01水平上具有统计学意义。图2 成年期 BDE-209 暴露对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响Fig.2 Effect of BDE-209 exposure on splenocyte proliferation in adult mice

2.7 成年期BDE-209暴露对小鼠脾脏IFN-γ和IL-4 mRNA表达的影响

由图5可知，PND77时，中、高剂量BDE-209可显著促进小鼠脾脏IFN-γ和IL-4 mRNA表达(P< 0.01)。PND98时，IFN-γ和IL-4 mRNA表达与空白组相比均未见显著性差异。由此可知，BDE-209暴露对IFN-γ和IL-4 mRNA表达具有一定的促进作用，但在停止暴露后可通过自我修复得到一定程度的恢复。

2.8 综合分析

2.8.1主成分分析(PCA) 由表4可知，所有特征值为1以上的保留因子共3个，累积贡献率达到82.085%，说明PCA成功将13个变量成功降维变成3个因子，且这3个因子保留了全部数据82.085%的信息。由表5可知，在第一主成分的特征向量中，荷载较高(>0.7)的指标有IFN-γ mRNA、IL-4 mRNA、淋巴IL-4、脾脏SOD、脾脏MDA、脾脏指数、淋巴IFN-γ；在第二主成分的特征向量中，荷载较高(>0.7)的指标有B细胞增殖、T细胞增殖；在第三主成分的特征向量中，荷载较高(>0.7)的指标有IgG。

2.8.2IBR分析 图6中的3个方向轴表示3种生物标志物(IgG、B细胞增殖、淋巴IL-4)，星状图围成的面积为IBR值。从图6中可以看出，在同一暴露剂量下，PND98的IBR值小于PND77的IBR值；与空白对照组比较，暴露剂量组IBR增大。表明BDE-209对成年期小鼠具有免疫毒性，但在停止暴露21 d后机体可通过自我修复降低该免疫毒性效应。

注：**表示与空白对照组相比，差异在P<0.01水平上具有统计学意义。图4 成年期BDE-209暴露对小鼠抗氧化能力的影响Fig.4 Effect of BDE-209 exposure on anti-oxidation capacity of adulthood mice

注：**表示与空白对照组相比，差异在P<0.01水平上具有统计学意义。图5 成年期BDE-209暴露对小鼠脾脏中IFN-γ、IL-4基因表达的影响Fig.5 Effect of BDE-209 exposure on IFN-γ and IL-4 mRNA expression in splenocytes in adult mice

图6 不同浓度BDE-209暴露后成年期小鼠IBR星状图Fig.6 IBR of adult mice exposed from different concentration of BDE-209

表4 元件提取结果Table 4 The results of component extraction

2.8.3析因分析 由表6可知，BDE-209剂量和是否度过恢复期对IgG、B细胞增殖、T细胞增殖、脾脏MDA、脾脏SOD、淋巴IL-4、IFN-γ mRNA、IL-4 mRNA具有极显著的交互性(P<0.01)，对脾脏指数、淋巴IFN-γ具有显著的交互性(P<0.05)，说明针对这些指标，BDE-209暴露毒性与剂量相关，并且可在停药21 d后得到有效改善。

表5 旋转元件矩阵Table 5 Rotated component matrix

表6 析因分析结果Table 6 The results of factorial analysis

3 讨论

胸腺和脾脏是重要的免疫器官，其指数变化可在一定程度上反映机体的免疫功能。BDE-209暴露降低了小鼠的脾脏指数和胸腺指数，表明其可导致胸腺和脾脏萎缩。Kreutz等[25]研究发现，暴露于农药成分的鱼比正常鱼的免疫球蛋白水平更高，揭示免疫刺激效应的有害性。因此，研究中发现的IgG水平升高，提示BDE-209暴露对成年期小鼠的免疫毒性。ConA诱导T淋巴细胞增殖，LPS诱导B淋巴细胞增殖，研究发现BDE-209显著抑制PND77的T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖，这与上述脾脏和胸腺萎缩的相关结果是一致的。Liu等[26]研究发现，暴露于BDE-209的大鼠淋巴细胞增殖受到抑制，这与我们的结果相似。

为了进一步探究BDE-209的免疫功能障碍，此次研究检测了胸腺和脾脏中的MDA和SOD水平。结果表明，BDE-209可提高MDA水平，降低SOD活性。先前对于BDE-209的甲状腺毒性研究发现，BDE-209可对甲状腺产生类似影响[27]。本团队已有研究表明BDE-209可通过氧化损伤产生免疫毒性，这与先前研究发现的机体对环境压力异常的应激反应和免疫毒性诱导反应一致[28]。

Th1型细胞因子IFN-γ是主要的促炎细胞因子，Th2型细胞因子IL-4是主要的抗炎细胞因子。先前研究表明，在一些感染性、自身免疫性/炎症性、过敏性(特应性)和肿瘤性疾病中，促炎和抗炎性细胞因子之间存在严重的不平衡[29]。此次研究发现，BDE-209暴露对IFN-γ分泌具有抑制作用，对IL-4分泌具有促进作用，提示对Th1反应的下调和对Th2反应的上调，反映了潜在的Th1/Th2失衡。IFN-γ基因表达与细胞因子分泌的变化趋势相反，推测是机体的负反馈调节所致。尽管IFN-γ与IL-4基因表达的变化趋势相同，但其变化程度不同，表明存在潜在的Th1/Th2失衡。

BDE-209对小鼠的影响经自我修复21 d后，所检测指标均趋向正常水平。相比空白对照组，脏器指标、IgG、脾淋巴细胞增殖及Th1/Th2相关基因mRNA水平均无统计学意义上的差异。低剂量组细胞因子分泌水平及SOD、MDA水平恢复正常，中、高剂量组差异仍有显著性。这些结果表明，BDE-209对成年小鼠的体液免疫和脂质过氧化具有较持久的影响，且主要发生在中、高剂量暴露下。

IBR可通过简单的多元图形方法(星状图)将各种生物标记物变化进行可视化。析因分析不仅可以检验各因素水平之间的差异，而且可以检验各因素之间的交互作用。为了全面分析BDE-209的免疫毒性，以及短期暴露于BDE-209是否可以通过停药后自我修复来降低其免疫毒性，可采用IBR和析因分析进行综合分析。PCA通过减少维数而不丢失重要信息来分析数据，此次研究考虑到大量的指标，使用它来选择用于IBR分析的生物标记物。经PCA分析，选择保留85.821%信息的3个主成分。选取3个与这3个主成分密切相关的生物标志物(IgG、B细胞增殖、淋巴IL-4)进行IBR分析。鉴于BDE-209暴露结束21 d后各组的IBR值均明显小于暴露结束时的IBR值，推测小鼠具有良好的自我修复能力。析因分析结果显示，对于多项检测指标，BDE-209的暴露剂量和是否度过恢复期之间存在交互影响，说明小鼠在切断暴露源后可有效降低BDE-209的毒性作用。这一结果与我们观察到的PND98大多数指标趋于正常一致。

综上，短期BDE-209暴露对成年期小鼠具有免疫毒性，但机体可在切断暴露源后通过自我修复得到一定程度的恢复。