白毛藤多糖对人卵巢癌A2780/DDP 细胞增殖和凋亡的影响

张杰，杨骄霞，翟凤国，周福波，林峰，李厚忠，杨旭东＊

（1.牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011；2.牡丹江医学院附属红旗医院，黑龙江 牡丹江 157011）

0 引言

顺铂(cisplatin，DDP)作用强、抗肿瘤谱广泛，对卵巢癌疗效显著，是化疗中常用的药物。其作用机制主要是诱发DNA 单链内或双链间相邻鸟嘌呤产生交联进而破坏DNA，抑制细胞DNA 自我复制[1-2]，但长期使用顺铂往往产生耐药性，限制其在临床化疗的应用。白毛藤（Solamum lyratum Thunb）属于茄科植物，具有消肿、解毒等作用。本课题组前期实验证实，白毛藤的不同组分对多种肿瘤细胞具有生长抑制等作用[3-4]，本研究旨在进一步观察白毛藤多 糖（Solamum lyratum Thunb polysaccharide，SLTP）在逆转A2780/DDP 人卵巢癌顺铂耐药中的作用及其分子机制，为SLTP 应用于卵巢癌的辅助化疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

A2780/DDP 人卵巢癌顺铂耐药细胞株，购于中科院上海细胞库。四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)、RPMI-1640 培养液和RNA 提取试剂(Trizol) (美国Sigma公司)，胰酶（美国Gibco 公司），DDP（德州德药制药有限公司），RT-PCR 试剂盒及引物（大连宝生物有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞分组

实验分为4 组，空白对照组（含A2780/DDP 细胞的RPMI-1640 培养液）、顺铂组（2µg/mLDDP）、顺铂+低剂量SLTP 组（2µg/mLDDP+0.4mg/mLSLTP）、顺 铂+高剂量SLTP 组（2µg/mLDDP+1.6mg/mLSLTP）。

1.2.2 测定药物敏感性的MTT 实验

将对数生长期A2780/DDP 细胞，以5×103个/mL细胞密度，接种至96 孔培养板上，每孔100 μL。按照细胞分组，分别加入不同浓度DDP 和SLTP，每个浓度设5 个复孔。分别孵育12，24 和48h 时各加入5g/LMTT20μL 溶液；继续培养4h，吸去全部上清液，每孔加100μLDMSO，酶标仪测定波长490nm 的各孔OD 值。细胞抑制率（inhibition rate，IR）=（对照组OD-实验组OD）/（对照组OD-空白组OD）×100%。

1.2.3 Hoechst33258 检测细胞凋亡

按照Hoechst33258 荧光染料试剂说明书检测A2780/DDP 细胞凋亡情况。固定：固定液4℃，10 min；漂洗：0.01mol/L PBS 漂洗3 次，5min/次；染色：Hoechst33258 染色液（5mg/L）染色15min；封片：封片剂（甘油与PBS 比例为1:9）封片。显微镜下观察到的蓝色深染、细胞核碎裂的细胞为凋亡细胞。细胞凋亡率={凋亡细胞/（凋亡细胞+正常细胞）}×100%。

1.2.4 反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测

设计引物如下：PTEN上游：5'-ATACCAGGACCAGAGGAAACCC-3'；下游：5'-TTGTCATTATCCGACGCTC-3'，扩增片段为101 bp。Survivin 引物，上游：5'-TTGGCAGGTGCCTGTTGAAT-3'；下游：5'-AGCCAGTCCCCCACAGCAT-3'，扩增片段329bp。GAPDH上游引物：5'-CGCCTGGAGAAAGCTGCTA-3'，下游：5'-ACGACCTGGTCCTCGGTGTA-3'，扩增片段288bp。条件：95℃预变性3min，94℃变性30s，55℃复性60s，72℃延伸55s，40 个循环，72℃复性5min。凝胶成像系统拍照，软件分析PTEN、SurvivinmRNA 的相对表达量。

1.2.5 统计学分析

2 结果

2.1 各组A2780/DDP 细胞药物敏感性情况

顺铂+低剂量SLTP 组和顺铂+高剂量SLTP 组能明显提高对A2780/DDP 细胞的生长抑制率，抑制肿瘤细胞生长，与顺铂组比较具有显著性差异（P＜0.01，P＜0.05），见表1。

表1 各组细胞生长抑制率（）

表1 各组细胞生长抑制率（）

注：与顺铂组比较，##P＜0.01，#P＜0.05。

2.2 各组细胞凋亡情况

不同浓度SLTP 联合顺铂作用于A2780/DDP 细胞后，各组细胞的凋亡率各不相同，与空白对照组凋亡率（2.98%）比较，顺铂组凋亡率（14.94%）显著升高（P＜0.01）。与顺铂组比较，顺铂+低剂量SLTP 组（17.17%）和顺铂+高剂量SLTP 组（23.61%）凋亡率明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05），见图1、2、3、4。

图1 空白对照组（400×）

图2 顺铂组（400×）

图3 顺铂+低剂量SLTP（400×）

图4 顺铂+高剂量SLTP 组（400×）

2.3 各组细胞PTEN、Survivin 基因表达情况

与顺铂组比较，不同剂量SLTP 联合顺铂作用于A2780/DDP 细胞48h 后，A2780/DDP 细胞中凋亡抑制因子Survivin 表达降低（P＜0.01，P＜0.05），促进细胞凋亡增加化疗敏感的PTEN表达增加（P＜0.01，P＜0.05），顺铂+高剂量SLTP 组最显著（P＜0.01），见表2、图5、6。

表2 各组A2780/DDP 细胞PTEN 和Survivin 基因表达（）

表2 各组A2780/DDP 细胞PTEN 和Survivin 基因表达（）

注：与空白对照组比较,** P＜0.01，* P＜0.05；与顺铂组比较,##P＜0.01，# P＜0.05。

图5 各组细胞survivin 基因表达

图6 各组细胞PTEN 基因表达

3 讨论

目前我国妇科的恶性肿瘤中死亡率最高的是卵巢癌[5-6]，顺铂是术后恢复的患者联合化疗的基础[7]。化疗的关键是提高顺铂的敏感性，降低耐药性，同时降低顺铂毒副作用。细胞凋亡抑制是肿瘤发生机制之一，抗凋亡基因及凋亡基因在这一过程中发挥着重要的作用，因此成为了卵巢癌治疗中的一个潜在的靶点。PTEN 基因定位于10 号染色体短臂（10q23.3），是一个双特异性磷酸酶活性的抑癌基因，可调控细胞周期，也可参与细胞间粘附[8-9]，作用于在多种肿瘤中可增加多种化疗药物的敏感性[10]。本研究证实，高低剂量的SLTP 分别与顺铂合用可明显上调A2780/DDP 细胞中PTEN 基因表达，随着药物剂量的增加，A2780/DDP 细胞中PTEN 基因表达逐步上调，与顺铂组比较，差异具有统计学意义。Survivin 属于凋亡抑制蛋白家族，不仅与肿瘤的发生发展有关，也与肿瘤化疗敏感性密切相关[11-12]。本研究证实，高低剂量的SLTP 分别与顺铂合用可明显下调A2780/DDP 细胞中Survivin 基因表达，随着剂量的增加，细胞中Survivin 基因表达显著下调，与顺铂组比较，差异具有统计学意义。

综上所述，SLTP 可通过调控Survivin 及PTEN基因的表达，从而辅助顺铂诱导A2780/DDP 细胞的凋亡并抑制A2780/DDP 细胞增殖，增加顺铂的药效。为SLTP 进一步应用于卵巢癌顺铂耐药的辅助治疗提供理论及实验依据，但其具体协同作用机制尚待进一步研究。