RNA m6A修饰在肺部疾病中的研究进展*

张哲明， 吴 艳， 卞 涛

（南京医科大学附属无锡人民医院呼吸与危重症科，江苏无锡 214000）

N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修饰是指RNA 中腺苷的第6 位氮原子处发生的甲基化修饰。在已发现的RNA 修饰中，m6A 修饰被认为是真核生物mRNA 中最常见的修饰类型。此外，这种甲基化修饰也可发生在rRNA、tRNA、miRNA、circRNA和lncRNA［1］。Dominissini 等［2］的研究显示，m6A 修饰位点主要集中在终止密码子附近和长内部外显子上，这些位点存在共有序列RRm6ACH（R=G/A，H=C/U/A），并且在人类和鼠之间高度保守。由于RNA 修饰增加了RNA 结构的复杂性，影响生物学过程［3］，因此了解m6A 修饰的功能和机制对于理解这种修饰在分子调控中的意义至关重要。m6A 修饰涉及翻译、剪接、RNA 降解、RNA 稳定性、miRNA 成熟等多种生物学过程［4］。m6A修饰通过甲基转移酶（writers）和去甲基化酶（erasers）的共同作用实现动态可逆调节，并且可以被m6A 结合蛋白（readers）选择性地识别结合，从而发挥作用。目前，对于m6A 修饰与肺部疾病的研究还很少，其中作用仍不清楚。本文总结有关m6A修饰的研究进展，并对m6A修饰与肺部疾病的关系进行了阐述，为深入了解肺部疾病中与m6A 修饰相关的分子标志物和治疗靶点提供参考资料。

1 m6A修饰概述

writers、erasers 和readers 共同组成m6A 修饰的调控网络，其中writers 负责催化形成m6A 修饰，erasers负责去除m6A 修饰，而readers 通过特异性识别m6A修饰的靶RNA，参与人类疾病的发生发展［5］。

1.1 m6A writers METTL3（methyltransferase-like 3）是第一个被发现的m6A 甲基转移酶。Bokar 等［6］从HeLa 细胞中将METTL3 分离出来，观察到它具有S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）结合活性。METTL3 通过与SAM 结合而获得甲基转移酶活性，在METTL3/METTL14 异二聚体和其他甲基转移酶组成的多组分甲基转移酶复合物中起着核心酶的作用。METTL14 作为支持酶，主要维持复合物完整性和与底物RNA 结合，增强催化活性。METTL14 C末端的RGG 重复序列是RNA 底物的结合位点，对于METTL3/14 的催化活性必不可少［7］。WTAP（Wilms′tumor 1-associated protein）是一种剪接调节因子，不具有催化域，对RNA 没有独立的催化能力，它通过与METTL3/14 相互作用，将后者定位到核散斑（nuclear speckles），从而激活甲基转移酶催化活性［8］。此外，RBM15、KIAA1429 等调控酶通过与mRNA 结合并募集METTL3/14 复合体，将其引导至靶区相互作用，但具体作用机制仍不十分清楚。目前，我们所知的甲基转移酶复合物中各组分的分子量相加与从HeLa 细胞中分离得到的复合物分子量并不相等，前者小于后者［9］。这表明甲基转移酶复合物中存在未知writer参与调控，需要进一步探究。

1.2 m6A erasers 去甲基化酶FTO（fat mass- and obesity-associated protein/ALKB homolog 9，ALKBH9）和ALKBH5 的发现揭示了m6A 修饰是动态可逆的，两者属于ALKB 相关蛋白家族。FTO 和ALKBH5 都是非血红素Fe2+/α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，α-KG）依赖的加氧酶，而Fe2+/α-KG 这一保守结构对于去甲基化修饰是必不可少的［10］。Su等［10］对FTO功能的进一步研究显示，FTO 在细胞核中催化m6A 的去甲基化，而在胞质中可同时介导m6A 和N6，2′-O-dimethyladenosine（m6Am）的去甲基化，但改变FTO 的表达水平对m6Am 修饰的RNA 的表达无明显影响，这说明FTO 主要在细胞核中介导m6A 修饰的RNA 的表达而发挥作用。ALKBH5 定位在细胞核，在低氧条件下表达上调。目前发现ALKBH5 在动物中表现出对m6A产生有效的去甲基化活性，这可能与ALKBH5的N 末端富含丙氨酸的序列和潜在的卷曲结构有关［11］。目前为止，还没有检测到主要定位于细胞质的m6A 去甲基化酶，对于胞质中RNA 的m6A 修饰如何调控仍未可知，值得进一步研究。

1.3 m6A readers readers 包括含YTH（YT521-B homology）结构域蛋白家族、核内不均一核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoproteins，hnRNPs）超家族、胰岛素样生长因子2 mRNA 结合蛋白（insulin-like growth factor 2 mRNA-binding proteins，IGF2BPs）、真核生物翻译起始因子3（eukaryotic translation initiation factor 3，eIF3）等，是m6A 修饰发挥作用的基础。

YTH 结构域是在人类剪接因子YT521-B 中被发现的，它在真核生物表达的100 多种蛋白中普遍存在。含YTH结构域蛋白家族分为YTHDF（YTHDF1～3）和YTHDC（YTHDC1～2）两个亚家族［12］。YTHDF1是一个重要的m6A 结合蛋白，其依赖eIF3 启动和增强翻译，促进m6A 修饰的mRNA 在5′-非翻译区（untranslated region，UTR）的非帽依赖性翻译。相反，YTHDF2 将识别的mRNA 转运到细胞质促进其降解。具体机制为YTHDF2 通过N 末端区域与CNOT1（CCR4-NOT transcription complex subunit 1）的SH 结构域直接相互作用，募集CCR4-NOT 复合体，从而促进染色质组装因子1（chromatin assembly factor 1，CAF1）和CCR4（carbon catabolite repressor 4）的去甲基化作用。YTHDF3 在YTHDF1 促进mRNA 翻译和YTHDF2 促降解中都起着协同作用，从而影响RNA的代谢［4，13］。YTHDC1 定位于细胞核，通过募集剪接因子SRSF3（serine and arginine rich splicing factor 3）和抑制SRSF10 与mRNA 结合，来调节核mRNA 的选择性剪接。YTHDC2可以选择性地与m6A残基结合，降低mRNA的m6A丰度，提高其翻译效率［14］。readers对mRNA 的翻译既有促进也有抑制作用，这表明readers 特异性识别m6A 修饰的RNA 位点，但其在翻译中的作用需要进一步研究。

已发现的与m6A 修饰有关的hnRNPs 超家族蛋白有HNRNPA2B1、HNRNPC 和HNRNPG，这些蛋白并不直接识别并结合m6A修饰位点，而是识别因m6A修饰而改变的RNA 结构，从而参与靶RNA 的加工、表达等过程。这种机制被称为m6A 开关（m6Aswitch）［15］。HNRNPA2B1 是一种细胞核中的m6A 结合蛋白，它与核转录本结合，调控RNA 剪接，并促进初级miRNA 的加工［15］。此外，IGF2BPs（IGF2BP1～3）是一种相对保守的m6A 结合蛋白，几乎只在细胞质中表达，能增强mRNA 的稳定性，提高翻译效率。目前已在多种侵袭性癌细胞中发现了IGF2BPs 的异常调节［16］。总之，m6A 结合蛋白几乎参与了RNA 代谢的每个环节，有很大研究价值。

2 m6A与肺部疾病

越来越多的研究表明，m6A 修饰与肺部疾病的发生发展密切相关，包括慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）、肺动脉高压（pulmonary hypertension，PH）、肺癌、肺纤维化等。

2.1 m6A 修饰与COPD COPD 是一种常见的以持续存在的呼吸系统症状和气流受限为特征的肺部疾病，气流受限不完全可逆，呈进行性发展。虽然吸烟、炎症机制、氧化应激、蛋白酶-抗蛋白酶失衡等都与其密切相关，但确切的发病机制仍不清楚［17］。

研究表明，在不影响细胞活力的前提下，暴露于不同浓度的香烟烟雾等有害物质刺激后，人肺泡上皮细胞中m6A 修饰水平均显著下降，但线性回归分析结果未提示有剂量效应关系［18］。通过数据集进一步分析细颗粒物对m6A 修饰调控因子表达的影响，研究者观察到高暴露组METTL3、WTAP、FTO、ALKBH5 和HNRNPC 的表达均高于低暴露组，而METTL14 和KIAA1429 的表达在两组之间无明显差异［18］。但是，近期Huang 等［19］用小气道上皮细胞为样本的研究显示，与对照组相比，COPD 组中FTO、METTL3、ZNF217、YTHDC1 和YTHDC2 表 达 下 调，IGF2BP3 表达上调。这可能意味着m6A 修饰的变化具有细胞类型特异性。进一步研究发现writers、erasers 和readers 之间并非孤立作用，而是存在协同性，m6A 调控因子之间的串扰可能在COPD 的发生中起重要作用。此外，m6A调控因子，特别是METTL3、FTO、YTHDC2 和IGF2BP3，还可以间接与一些COPD关键基因相互作用，影响这些基因的表达，从而参与细胞对外源物质刺激的反应、脂质代谢等生物学过程，促进COPD 进展［19］。总而言之，该研究首次系统地证明了m6A 调控因子在COPD 中的表达和潜在功能，但其中具体的作用机制仍需进一步研究。

2.2 m6A 修饰与PH PH 是一种以肺动脉压力升高为表现形式的血流动力学状态，其定义为海平面、平卧静息状态下，经右心导管测量平均肺动脉压力（mean pulmonary artery pressure，mPAP）≥25mmHg。其中，低氧性肺动脉高压（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）是一种由肺部疾病引起的进展性疾病，常见病因为COPD 和间质性肺疾病。目前针对此类疾病尚无有效的治疗方法［20］。

缺氧可导致m6A 修饰失调，从而促进疾病的发生发展，同时缺氧对m6A 修饰的影响具有细胞类型特异性［21］。既往对于circRNA 中的m6A 修饰知之甚少，但Zhou 等［21］鉴定出数千个细胞特异性表达的m6A 修饰的circRNA，扩大了人们对m6A 修饰理解的广度，并揭示了m6A 修饰对circRNA 的调节。Wang等［22］首次通过基因芯片分析确定了HPH 小鼠模型肺组织中circRNA 的表达图谱。在此基础上，Su等［23］进一步研究发现，从HPH 大鼠肺组织中分离获取的总circRNA 的m6A修饰水平低于正常对照组；近半数circRNA 跨越一个外显子，并且来源于单个外显子的circRNA 中存在丰富的m6A 修饰。虽然m6A修饰上调或下调的circRNA 的亲本基因在蛋白质修饰过程中都富集，但两者的作用途径明显不同。m6A修饰上调的circRNA 的亲本基因主要在催产素信号通路、内质网蛋白加工、cGMP-PKG 信号通路及血管平滑肌收缩通路中富集，而下调的主要参与紧密连接和赖氨酸降解。与无m6A 修饰的circRNA 相比，m6A修饰的circRNA 在缺氧时有明显减少的趋势，这提示缺氧时m6A 可能下调circRNA 的表达［23］。circRNA具有miRNA 海绵的作用，可参与miRNA 相应靶基因的表达［24］。为探索circRNA-miRNA 调控对PH 相关基因表达的影响，研究者通过构建circRNA-miRNAmRNA 网络，筛选了与Wnt［25］和FoxO［26］这2 条参与PH 进展的信号通路相关的关键mRNA 和miRNA，经检测显示circXpo6和circTmtc3变化最明显。经RNA免疫沉淀（RNA immunoprecipitation，RIP）-PCR 证实，在低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞和内皮细胞中，m6A 修饰的circXpo6 和circTmtc3 表达显著下调［23］。总之，该研究的结果表明m6A 修饰的circRNA 与PH有关，m6A 通过影响circRNA 的稳定性，导致Wnt 和FoxO 信号通路激活，最终促进HPH 的发生发展［23］。然而，缺氧影响m6A 修饰的确切机制尚未得到证实，该研究也没有详细阐述m6A修饰在HPH中的作用。

2.3 m6A 修饰与肺癌 肺癌是一种由肺上皮细胞恶性增殖而形成的肿瘤。在肺癌的发生发展中，m6A修饰发挥着重要作用。m6A 相关蛋白表达的异常能导致非小细胞肺癌的增殖、侵袭、转移和耐药等。

上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是恶性肿瘤细胞获得侵袭和迁移能力的关键。最近有研究表明，METTL3在香烟烟雾提取物诱导的EMT 中起关键作用，它通过上调ZBTB4 mRNA 的m6A 修饰水平来诱导EMT 和肺癌的发生［27］。Xue 等［28］的研究启发了我们对m6A 和lncRNA在肺癌中作用的理解：lncRNA ABHD11-AS1 在功能上可以促进非小细胞肺癌的增殖和Warburg效应，其异位过表达与非小细胞肺癌患者的不良预后密切相关，而METTL3可以通过增强ABHD11-AS1的转录稳定性，上调其表达。此外，miR-600 和miR-33a 可通过抑制METTL3的表达，逆转METTL3对非小细胞肺癌进展的积极作用［29］。

去甲基化酶FTO 是肺鳞癌的一个预后因素，过表达的FTO 通过降低MZF1 mRNA 的m6A 修饰水平和稳定性来增强MZF1 的表达，从而发挥致癌作用［30］。过去我们认为ALKBH5 在非小细胞肺癌中呈异位上调，且与预后不良密切相关。但最近Jin 等［31］的研究表明，ALKBH5也可通过降低YTHDFs介导的YAP 表 达 和 抑 制miR-107/LATS2（large tumor suppressor kinase 2）介导的YAP 活性来抑制非小细胞肺癌的生长和转移。综上所述，ALKBH5 可抑制肿瘤进展，而FTO 促进肿瘤形成，若要具体阐明它们作用的差异，则需要进一步研究。

Sheng 等［32］观察到YTHDF2 在非小细胞肺癌中表达上调，它通过直接与6-磷酸葡萄糖脱氢酶3′-UTR 的m6A 修饰位点结合，增强磷酸戊糖途径，为癌细胞增殖提供能量。与之相反，YTHDC2 在非小细胞肺癌中表达下调，并且其低表达与肿瘤的低分化、淋巴结转移、肿瘤大小和分期显著相关，这表明YTHDC2 抑制非小细胞肺癌的发生发展［33］。我们推测不同RNA 的m6A 修饰发生变化后，转录后调控方式的差异是RNA被不同的m6A结合蛋白选择性识别所导致的。而m6A 结合蛋白如何选择性识别，具体的分子机制仍需探索。

2.4 其 他 Dai 等［34］基 于WTAP、KIAA1429、YTHDC2、FMR1和ZC3H13这5个m6A 调控因子构建了预测儿童哮喘风险的模型，将哮喘儿童分为A 组和B 组，B 组的m6A 评分高于A 组，并且检测到A 组患儿与辅助性T 细胞1 型的免疫相关，而B 组患儿与辅助性T 细胞2 型的免疫相关。另外，Kim 等［35］观察到在人原代气道上皮细胞中，FTO缺失会导致FOXJ1 mRNA 稳定性降低，同时纤毛上皮细胞明显减少，杯状细胞增多；而FTO敲除的小鼠由于纤毛上皮细胞缺陷，在过敏原刺激下表现出强烈的哮喘样表型。由此可见，m6A 调控因子在哮喘的发生中起着不可忽视的作用。

Han 等［36］在肺纤维化方面的研究显示，碳黑处理后的大鼠肺组织中pri-miRNA-126 的m6A 修饰水平下调，阻碍了miRNA-126的成熟，进而激活其下游靶向调控基因PI3K介导的PI3K/AKT/mTOR 通路，引起肺组织纤维化。

在炎症反应中，ALKBH5基因敲除可抑制靶细胞活力，诱导细胞调亡，减少炎症细胞因子的产生［37］。此外，Zhao 等［38］的研究显示ALKBH5 还可以下调IL6mRNA 的m6A 修饰水平，抑制其核质转运，减轻放射性肺炎的损害。

3 m6A在肺部疾病中的潜在应用

3.1 m6A修饰可作为肺部疾病的生物标志物 特征性生物标志物在疾病的预防、诊断和治疗中起着至关重要的作用。上述的研究已表明，m6A异常修饰会影响肺部疾病的进展。例如，在HPH 中，m6A 修饰的circXop6 和circTmtc3 显著下调［23］。而circRNA 在特定的细胞类型或组织中有不同程度的富集，且不易降解，较miRNA、mRNA 等稳定。随着m6A 修饰检测技术的创新，m6A修饰可作为一种有前景的肺部疾病诊断生物标志物。早期检测到circRNA m6A 修饰水平的变化可能有助于监测和预防疾病的发生发展。

3.2 m6A修饰可作为肺部疾病的治疗靶点 越来越多的研究表明，m6A 修饰在肺部疾病中具有重要作用，为以相关甲基转移酶、去甲基化酶、m6A结合蛋白或m6A修饰的RNA为靶点的创新治疗方案提供了新见解。最近，Li 等［39］通过将一种催化失活的酶连接到ALKBH5 上，创造了一种融合蛋白dm6ACRISPR，它可以特异性地将靶转录本去甲基化。这种靶向调控m6A 修饰的融合蛋白有可能用于调节肺部疾病的基因表达和细胞功能。但目前针对m6A 修饰的治疗方案仍处于初级阶段，还有很多问题有待解决，如治疗位点的选择、治疗的副作用和人类个体差异等。

4 问题与展望

m6A修饰是一个迅速发展的新兴研究领域，尽管在调控机制和肿瘤方面的研究已有所进展，但是m6A修饰调控基因的机制是复杂的，不同细胞中的机制也不尽相同，因此需要研究者们进一步研究其在病理状态下确切的变化和作用机制。目前m6A 修饰在肺部疾病中的研究较少，特别是在COPD等慢性肺疾病中的确切作用仍不清楚，因此m6A 修饰在肺部疾病相关领域的研究需进一步深入，以期其能够成为临床评估和诊治疾病的生物标记物及治疗靶点。