多发性硬化中microRNA-155对中枢神经系统细胞的影响①

张栋亮 唐玉兰 （广西医科大学第一附属医院神经内科，南宁530021）

microRNAs（miRNAs）是一种长度约20～24个核苷酸小的非编码RNA分子，可结合靶标蛋白mRNA序列的3′URT，通过mRNA翻译抑制或降解在转录后发挥调控基因表达的作用，影响着细胞发育、分化、增殖、代谢和凋亡等生物学过程。近年来，miR‐NAs在炎症性疾病中作为生物标志物、调节因子和潜在治疗靶点的研究越来越多，其作为某些趋化因子、细胞因子等炎症相关介质的重要转录调控因子，影响着炎症性疾病的发生、发展及治疗等方面，其中microRNA-155（miR-155）通过调控外周免疫细胞和中枢神经系统驻留细胞的增殖、活化、极化、迁移等在神经炎症过程中发挥重要作用［1］。

多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是一种自身免疫介导的中枢神经系统（central nervous system，CNS）慢性炎性脱髓鞘疾病，其发病机制复杂，涉及外周、中枢免疫系统和包括免疫细胞、神经元、神经胶质细胞、血脑屏障细胞等在内的各类型细胞间复杂的相互作用，最终导致大脑和脊髓发生局灶性炎性脱髓鞘、轴突损伤和弥漫性神经退行性病变［2-3］。自JUNK‐ER及LESCHER等［4-5］发现miR-155在MS患者、MS动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental au‐toimmuneencephalomyelitis，EAE）小鼠及EAE狨猴活跃的白质病灶中的表达较对照组显著升高以来，越来越多的研究证实了miR-155在MS中的重要作用。O′CONNELL等［6］也发现了miR-155-/-小鼠对EAE的诱导具有高度抗性，由此可见病灶中上调的miR-155对MS/EAE的发生发展在总体上可能起到了促进的作用，而在单个细胞层面上探究miR-155有助于加深了解miR-155对MS/EAE在总体上的这种促进作用。本文就miR-155的异常表达对神经胶质细胞、血脑屏障细胞等中枢神经系统细胞在不同功能状态下的调控作用进行回顾，从而探讨miR-155在MS发病过程中的作用并借此提出新的治疗观点。

1 miR-155与星形胶质细胞

1.1 星形胶质细胞的生物学功能 星形胶质细胞由于神经营养因子的产生及其在调节细胞外谷氨酸和钾浓度方面发挥关键作用，在传统上被认为具有营养作用，且激活的星形胶质细胞分泌的炎症介质对机体抵抗病原体至关重要，但持续活化的星形胶质细胞分泌过多的促炎细胞因子，这与神经炎症和神经退行性病变相关［7］。因此，星形胶质细胞依据其不同的活化表型（A1型和A2型）发挥双重功能，这与巨噬细胞极化的功能表型颇为相似。星形胶质细胞已被证实是与MS病变发展密切相关的细胞，在炎症后期可形成胶质瘢痕，但目前研究发现星形胶质细胞在MS疾病进展过程的早期及活跃期也发挥着重要作用［8］。

1.2 miR-155对星形胶质细胞的调控 在MS病变早期，反应性星形胶质细胞摄取髓鞘碎片，诱导核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）和丝裂原活化 蛋 白 激 酶（mitogen activated protein kinases，MAPKs）信号通路的传导，促进细胞间趋化因子（CCL3、CCL5、CCL20、CXCL10等）的分泌，以上趋化因子的分泌可能诱导了外周T淋巴细胞及巨噬细胞向CNS迁移及浸润，加重了疾病的炎症反应及髓鞘的脱失［9］。当然，这些免疫细胞向CNS迁移和血脑屏 障（blood brain barrier，BBB）的 通 透 性 有 关 。JUNKER等［4］通过激光捕获显微解剖（laser capture microdissection，LCM）技术从活跃的MS病灶收集到的星形胶质细胞中发现了miR-155表达水平较对照组显著上调。miR-155的表达上调与影响BBB通透性的基质金属蛋白酶3（Matrix metalloproteinases 3，MMP3）在星形胶质细胞中的表达升高相关，KO‐ROTKOV等［10］在体外细胞培养中发现转染miR-155抑制剂后可以削弱MMP3在IL-1β刺激的星形胶质细胞中的表达，miR-155可能通过活化MAPKs通路下游的激活转录因子AP-1和NF-κB介导了MMP3的表达。TARASSISHIN等［7］在研究中还发现了抑制miR-155在星形胶质细胞中的表达可下调IL-1/IFN-γ诱导的TNF-α、IL-6和IL-8等促炎细胞因子的表达，miR-155通过靶向抑制细胞因子信号抑制物1（cytokine signal suppressor 1，SOCS1）的转录从而发挥炎症诱导的作用。这表明miR-155参与调控炎型A1星形胶质细胞的活化及其细胞因子的表达，对MS病灶中炎症环境下的星形胶质细胞的功能变化具有很好的参考意义。类似地，miR-155通过靶向抑制SOCS1的表达来调控星形胶质细胞的活化并影响神经炎症的进展也见于阿尔茨海默病（alzheim‐er disease，AD）和帕金森病（parkinson′s disease，PD）等神经退行性疾病［11-12］。此外，具有诱导神经元及少突胶质细胞死亡功能的A1星形胶质细胞在MS、AD、PD等疾病的大脑样品组织中被高度发现，尽管MS的发病机制和AD、PD等疾病各有不同，miR-155通过影响星形胶质细胞的活化和相应细胞因子的分泌来调控以上疾病炎症，这与神经退变的病程进展是有着相似之处的［13］。当然，miR-155对MS等疾病病程的影响还通过调控其他神经胶质细胞的功能状态来实现。

2 miR-155与小胶质细胞

2.1 小胶质细胞的生物学功能 小胶质细胞，即大脑的巨噬细胞，是组成大脑固有免疫系统的驻留细胞之一，可持续监测其周围环境，以发现感染或稳态扰动事件的迹象。在CNS功能正常期间，小胶质细胞发挥着维持细胞突触和髓鞘稳态的功能。神经元、星形胶质细胞、血脑屏障细胞和T淋巴细胞等对小胶质细胞的差异激活是神经炎症的调节枢纽，活化后的小胶质细胞表现出增殖的迹象，其迁移、吞噬和抗原提呈能力得到了提高，并且分泌过多的炎症介质［14］。因此，小胶质细胞不仅是CNS稳态的守护者，也是CNS疾病发生、发展的参与者。

2.2 小胶质细胞在MS发病机制中的作用 在MS及其动物模型EAE病灶中，活化的小胶质细胞内含有髓鞘碎片和轴突残体，MHCⅠ类、Ⅱ类分子和共刺激分子表达升高，并分泌大量的炎症介质和神经毒性介质。而且在EAE中，CD40+小胶质细胞可以招募CD40L+CD4+T淋巴细胞进入病灶，CD11C+呈树突状细胞样的小胶质细胞有助于将抗原提呈至CD8+T淋巴细胞。此外，活化的小胶质细胞通过分泌TNF-α调控T淋巴细胞向致病性的Th1淋巴细胞和Th17淋巴细胞分化，且小胶质细胞分泌的部分炎症介质，包括Ⅰ型IFN和IL-18，以及表达上调的CD45、MHCⅠ类、Ⅱ类分子和共刺激分子，刺激了Th1和Th17淋巴细胞亚群的增殖［2］。GOLDMANN等［15］研究还发现，在EAE小鼠中小胶质细胞的消耗或小胶质细胞特异性基因TGF-β活化酶1的下调可以缓解脱髓鞘的进展，减轻疾病的严重程度。由此可见，调控小胶质细胞的活化和增殖以减轻髓鞘和轴突的损伤可能是MS潜在的一种治疗方案。

2.3 miR-155对小胶质细胞的调控 miR-155在小胶质细胞的活化、增殖、炎症等方面获得了较为广泛的研究。FREILICH等［16］在对原代培养的小鼠小胶质细胞进行M1样和M2样表型诱导后，对具有促炎特性的M1样表型小胶质细胞的miRNA进行了微阵列表达谱分析和生物信息学分析发现miR-155是表达上调最显著的miRNA之一。MOORE等［17］通过LCM技术从脑实质中捕获到CD68+小胶质细胞并进行miRNAs分析，发现miR-155在MS病人小胶质细胞中的表达较对照组明显上调，并且体外培养的小胶质细胞转染了miR-155模拟物后，CCR7、CD80和CD86等细胞表面分子表达增加，miR-155的靶向基因SOCS1表达下调，并进一步导致TNF-α、IL-6等炎症介质合成增多。miR-155的表达升高也在红藻氨酸刺激的小胶质细胞中被发现，而在小胶质细胞培养基中加入miR-155拮抗剂共培养后，促炎细胞因子IL-1β和IL-6的表达被削弱，同时红藻氨酸诱导的小胶质细胞的活化形态在很大程度上被逆转［18］。TNF-α、IL-6、IL-1β和CCR7、CD80、CD86分别是M1型小胶质细胞相关的细胞因子和细胞表面分子，以上研究在一定程度上表明miR-155参与了小胶质细胞的活化并调控其活化的方向，使小胶质细胞在特定的病变阶段发挥相应的功能。

鉴于miR-155在小胶质细胞活化过程中发挥的重要作用，通过靶向调控miR-155的表达来影响小胶质细胞的活化状态从而观察疾病变化的研究越来越多。miR-155-/-PD模型小鼠由于miR-155的缺失，α-突触核蛋白诱导的促炎反应和神经退行性病变减弱［19］。创伤性脑损伤模型小鼠给予脑室内注射miR-155拮抗剂后，脑损伤诱导的促炎基因表达下调，皮层损伤的病灶范围缩小，小鼠的认知功能、运动能力等得到相应恢复［20］。总之，研究表明miR-155作为CNS炎症性疾病的重要调控因子，影响小胶质细胞的多种功能，包括激活、增殖、炎症及细胞间的相互作用等，通过靶向miR-155调控小胶质细胞极化的方法在CNS相关疾病的治疗计划中起着不可忽视的作用，这也为MS的治疗揭示了一个新的方向。

3 miR-155与少突胶质细胞

3.1 少突胶质细胞的生物学功能 少突胶质细胞是由神经干细胞分化而来，其发育过程经历神经祖细胞、少突胶质细胞祖细胞、少突胶质细胞前体细胞、幼稚少突胶质细胞和成熟少突胶质细胞几个时期［21］。成熟的少突胶质细胞对轴突进行包裹并提供营养支持，同时释放的乳酸被轴突摄取并用于线粒体ATP合成，而且少突胶质细胞间的缝隙连接结构有利于保持BBB完整性，并对CNS内髓鞘和轴突的发育和维持发挥重要作用［22-23］。

3.2 少突胶质细胞在MS发病机制中的作用 少突胶质细胞由于其复杂的分化程序和独特的代谢生理，是CNS中最易受到病理损伤的细胞之一。在MS复杂的病理过程中，少突胶质细胞发生功能障碍及细胞死亡并引发脱髓鞘和神经退行性病变。CNS发生急性脱髓鞘后，少突胶质前体细胞增殖、迁移到病灶后分化为成熟少突胶质细胞，合成新的髓鞘［24］。但是其合成总体上是低效的，可能是由于MS病灶处轴突再髓鞘化形成的髓鞘较正常短、薄，同时，随着年龄的增加及MS病程的延长，髓鞘再生的速度也在逐渐下降［25］。此外，在MS中少突胶质前体细胞向病灶处迁移、招募受损及低分化率等表现，共同导致了脱髓鞘和轴突变性过程的持续进行［22］。因此，促进少突胶质前体细胞招募、分化的能力，提升受损轴突再生髓鞘的有效性是保护轴突、逆转神经功能障碍和预防MS进展性疾病的有价值的研究途径。

3.3 miR-155对少突胶质细胞的调控 CANTONE等［26］利用生物信息学和Meta分析对少突胶质细胞系分化的复杂过程进行研究推测出miR-155是少突胶质细胞系分化的关键调控因子之一，并进行了验证，miR-155作为前馈环路（Sox10→miR-338/miR-155★Tcf7L2）核心因子之一可通过抑制转录生长因子7类似物2（transcription factor 7 like 2，Tcf7L2）的翻译，进而导致少突胶质细胞系分化缺陷或不完整。这与Tcf7L2作为典型Wnt信号通路调控少突胶质细胞分化的关键核内成分一致，也表明miR-155是少突胶质细胞分化成熟及再髓鞘化的潜在调控靶点之一［27］。HAN等［28］人在神经毒剂CPZ诱导的小鼠脱髓鞘模型中发现miR-155-5p和miR-20a-5p等240个miRNAs的表达发生了显著变化，而且Smad2和Smad3的表达和磷酸化显著降低，脱髓鞘时Smad4和Id1表达下调，具有抑制轴突再生及修复的NOGO受体表达显著上调。因此，以上结果表明在脱髓鞘过程中上调的miR-155-5p和miR 20a-5p可能通过靶向抑制Smad信号级联而诱导轴突上NOGO受体的表达，进而诱导脱髓鞘的持续发生。此外，上调的miR-155还可通过靶向下调少突胶质细胞膜表面CD47分子的表达，从而减弱巨噬细胞/小胶质细胞对轴突的吞噬抑制［4］。综上，过表达的miR-155在脱髓鞘及轴突修复过程中扮演着有害的角色。不过有趣的是，miR-155在病程的某个阶段似乎还具有促进受损轴突再髓鞘化的作用，JIANG等［29］研究发现miR-155在CNS的Notch信号通路中发挥着重要作用，过表达miR-155可下调Notch1的表达，而Notch1是影响少突胶质前体细胞分化的信号通路之一并与受损或低效的再髓鞘化形成机制相关，二者间是否存在相关性有待进一步深入研究［30］。目前MS或EAE病灶分离出少突胶质细胞并对miR-155的表达水平尚未报道，miR-155对少突胶质细胞的影响更多的是如前文所述，主要还是通过调控星形胶质细胞、小胶质细胞及外周免疫细胞的功能状态在髓鞘破坏及再合成过程的不同阶段来发挥作用。

4 miR-155与BBB

4.1 BBB的生物学功能 BBB是微血管内皮细胞与外周细胞、星形胶质细胞、神经元和细胞外基质等密切接触而形成的血管系统网络，多数影响CNS稳态的代谢变化都是通过这个调控网络发生的。BBB通过其屏障细胞间复杂的相互作用来限制并防止外源性物质、代谢毒物和免疫细胞等进入CNS，发挥维护CNS稳态的作用。

4.2 BBB在MS发病机制中的作用 BBB功能的减弱是MS早期病理变化之一，在活跃的MS病变中，通过各种细胞黏附分子、整合素、细胞因子和趋化因子的调控下，大量白细胞经免疫激活的BBB迁移至脑实质，进而导致不可逆的脱髓鞘、组织损伤和轴突功能障碍［3］。虽然BBB功能障碍的机制尚未完全清楚，但在MS中白细胞或大脑驻留细胞活化后释放的促炎细胞因子如TNF-α及IFN-γ等，在体外实验中已被证实可以改变构成BBB的内皮细胞的生理功能，使它们的通透性增加，并影响紧密连接蛋白的表达［31-32］。因此，明确MS中引起BBB功能障碍的分子调控网络中的关键因子，并通过一定的干预措施来促进BBB功能恢复从而减轻大脑免疫损伤和恢复脑内稳态，是研究MS发生发展机制及治疗策略的切入点之一。

4.3 miR-155对BBB细胞的调控 已有研究证实了人血管内皮细胞在炎症刺激下能上调miR-155的表达，抑制或过表达miR-155可分别降低或增加血管 内 皮 通 透 性 ，进 而 影 响BBB功 能［29，32-33］。MANKERTZ等［31］使用LCM技术分离白质的微血管，并研究miR-155在MS活动性病灶的神经血管单位水平上的表达是否发生改变。研究发现，与非神经系统疾病的对照组白质及MS患者正常白质组相比，活跃的、持续脱髓鞘的、炎症性的MS病灶白质的神经血管单位中miR-155的表达水平显著升高。此外，在动物实验中发现miR-155-/-EAE小鼠与对照组EAE小鼠相比，示踪剂FITC-dextran在BBB上的渗漏减少了50%，说明miR-155对BBB完整性的维持产生不利的影响。这种不利的影响可能源自以下几个方面：首先，过表达的miR-155通过靶向mRNA序列的3′URT抑制内皮细胞间黏着斑组分（DOCK-1、SDCBP）和连接复合体组分（ANXA-2、CLDN-1）的翻译造成的［32，34］。其次，过表达的miR-155还可以通过影响调控内皮细胞黏附分子VCAM1和ICAM1表达的基因，在一定程度上增强VCAM1和ICAM1的表达，同时miR-155还可能靶向抑制NF-κB激酶相互作用蛋白的抑制剂，导致转录因子NF-κB核转位增加，促进VCAM1和ICAM1的表达，进而促进单核细胞和T细胞等炎症细胞在血流剪切力作用下黏附内皮细胞［35］。最后，过表达的miR-155还可以靶向下调内皮细胞一氧化氮合酶（eNOS）的表达及NO合成，而eNOS参与了EAE小鼠BBB的形成和维持，且给予外源性NO可减轻EAE临床症状［29，36］。此外，除了内皮细胞自身过表达的miR-155增加了BBB的通透性之外，其他细胞合成的miR-155还有可能通过外泌体搭载进入内皮细胞并破坏紧密连接和内皮屏障的完整性［34］。构成血脑脊液屏障的脉络丛上皮细胞被LPS刺激活化后，向脑脊液中释放包含miR-155的外泌体，可进入脑实质并被星形胶质细胞和小胶质细胞摄取，从而诱导miR-155的靶向抑制与炎症反应的激活［37］。在机体受到炎症刺激后，大脑屏障细胞感应炎症信号后分泌包含miR-155的外泌体，并通过作用于脑实质受体细胞将这种信息传递到CNS，鉴于这一过程在炎症性疾病中的重要作用，抑制携带炎症信号外泌体的合成等方法可能成为疾病治疗新方案的依据。

5 小结与展望

目前miR-155在MS中的研究更多的是集中在外周免疫细胞，中枢神经系统细胞则相对较少，但仍有部分研究阐明了miR-155在MS发病机制中作用。MS/EAE病灶中上调的miR-155，一方面通过活化星形胶质细胞及小胶质细胞成为炎症细胞在MS/EAE的炎症损伤中发挥作用；另一方面可能通过抑制少突胶质细胞的分化使得受损轴突的再髓鞘化受阻，同时miR-155降低BBB通透性使得外周免疫细胞更易进入CNS对髓鞘造成持续损伤。由此可见，miR-155有望成为MS患者强有力的治疗靶点，不过需要注意的是，miR-155由于有多个靶向基因位点，且在不同细胞中的作用存在差异性，其临床上的应用价值应需从个体的总体效应进行综合评价。

miR-155作为疾病的生物标志物及药物疗效监测指标的临床研究越来越多，miR-155在MS诊断及分型方面的作用在研究报道中也渐渐得到肯定。随着体内传递miRNAs模拟物及抑制剂的技术逐渐发展，且miRNAs药物也已经进入相关疾病的临床试验，在未来，miR-155的靶向治疗在MS的诊治中或许会大放异彩。