β-葡聚糖引起的训练免疫和LPS引起的免疫耐受在表观遗传和代谢水平的异同①

花 晴 申雪芳 许平波（复旦大学附属肿瘤医院麻醉科，上海 200032）

脓毒症是机体对炎症反应失调导致的严重威胁生命的多器官功能损害，其本质在于免疫调节紊乱。一方面，过度的免疫反应可引起脏器功能损伤；另一方面，全身性免疫抑制可导致细胞因子缺乏，使机体存活的免疫细胞不能进行有效的克隆增殖，进而对病原体产生有效的免疫应答而形成免疫耐受［1］。目前，早期脓毒症的死亡率逐渐降低，而因过度炎症反应或免疫耐受所致的二次感染是脓毒症患者死亡的主要原因，使研究聚焦在脓毒症导致的免疫改变上［2］。传统观点认为，免疫反应可分为固有免疫反应和适应性免疫反应，与前者相比，后者反应慢但更具特异性，且可产生免疫记忆。现有研究证实，在炎症感染或接种疫苗后，固有免疫细胞如单核细胞可因表观遗传改变而产生固有免疫记忆，当病原体再次入侵时产生一种更加强烈的固有免疫反应，称为固有免疫记忆或训练免疫（trained immunity，TI）［3］。临床试验和动物实验研究表明，脓毒症后免疫耐受的形成并不可简单归纳为某一特定通路受模式识别受体（pattern recogni‑tion receptor，PRR）的影响无法激活下游基因，而是其自身染色质和转录因子发生改变进而导致耐受基因形成，使其在表观遗传和代谢水平均发生改变［4］。

单核细胞是骨髓细胞和组织巨噬细胞的中间体，是固有免疫系统的重要组成部分［5］。当机体受病原体入侵时，单核细胞迅速趋向病原体，并分化为巨噬细胞来清除病原体，恢复组织完整性［6］。单核细胞及由单核细胞分化而来的巨噬细胞的功能表型取决于感染后免疫系统的功能状态，即免疫耐受或TI［7］。在脓毒症最初发生的数小时内，固有细胞免疫耐受可保护机体免受过激的炎症反应影响［8］。而持续的免疫耐受可使机体进入一种“免疫麻痹”状态，单核/巨噬细胞表现为促炎症因子分泌减少或基本不分泌，人体白细胞抗原DR（human leu‑kocyte antigen DR，HLA-DR）表达下降，单核细胞诱导的抗原特异性T淋巴细胞活性降低，单核细胞释放多种细胞因子能力的改变，多形核白细胞无反应性［9-11］。而特定感染如卡介苗注射等可延长单核细胞的作用时间并在病原体二次入侵时产生更加强烈的固有免疫反应，即TI［12-15］。本文将围绕脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）引起的免疫耐受和β-葡聚糖引起的TI在表观遗传学和代谢方面的异同展开，以期为临床治疗脓毒症后免疫耐受提供帮助。

1 引起TI或免疫耐受的表观遗传学改变

1.1 LPS或BG介导的组蛋白表观遗传修饰 表观遗传学是指在基因的DNA序列没有发生改变的情况下，基因功能发生了可遗传的变化，并最终导致表型的变化。LPS产生的免疫耐受与β-葡聚糖（βglucan，BG）引起的TI均与特定的表观遗传状态密切相关［16-17］。近期研究表明，在真核细胞染色质中，组蛋白第三亚基4号赖氨酸的表观遗传修饰在免疫记忆和免疫耐受过程中发挥重要作用，其三甲基化水平（histone 3 lysine 4 methylation3，H3K4me3）能够有效调控基因沉默和发育；而组蛋白第三亚基27号赖氨酸的乙酰化水平（histone 3 lysine 27 acetyla‑tion，H3K27ac）则通过调控增强子和启动子的激活进一步调控真核细胞的基因转录［18］。真核细胞转录调控的实现，主要依赖于转录因子（transcription factors，TFs）和转录因子结合位点（transcription fac‑tor binding sites，TFBSs）的相互作用。二者结合后可构成转录因子结合模体（transcription factor bind‑ing motifs，TFBMs），进而调控真核细胞的基因转录［19-20］。

有研究表明，缺乏T细胞和B细胞的小鼠在受到白色念珠菌二次感染时，BG会通过C型凝集素受体（dectin-1）和Raf-1-依赖性通路引起单核细胞的功能重塑，促进其释放细胞因子增多，成为抵御病原体的主体［21］。单核细胞的上述功能改变与稳定的组蛋白H3K4三甲基化改变有关，说明TI的形成与表观遗传改变，特别是组蛋白的改变密切相关。SAEED［16］等将从健康志愿者外周血中提取的单核细胞分别给予BG和LPS刺激以形成TI和免疫耐受。对组蛋白标记H3K4me3、H3K4me1、H3K27ac和脱氧核糖核酸酶Ⅰ（deoxyribonucleaseⅠ，DNaseⅠ）进行表观基因分析发现，在单核细胞分化为巨噬细胞的过程中，TI细胞中表达代谢相关酶及炎症因子的基因增多，而免疫耐受细胞中这些基因表达减少；约12%的TFs参与调节免疫耐受和TI的形成，且在特定动态表观区的DNaseⅠ超敏位点发现了TFBMs，说明免疫耐受和训练记忆的表观遗传改变需要特定的TFs。有研究将单核细胞分别暴露于LPS和BG中24 h，再培养5 d后进行表观遗传学分析，结果发现：在3 200多个与脂质代谢、白细胞分化及溶酶体相关的增强子组成的区域中，与对照组相比，暴露于BG的单核细胞H3K27ac沉积较多，H3K4me1沉积也较多，并抑制了H3K27me3的沉积，H3K27ac的聚集与H3K4me1一致；而暴露于LPS的单核细胞几乎无H3K27ac沉积，但H3K27me3沉积较多，且相应的H3K4me1沉积较少［22］。该研究表明，BG可促进巨噬细胞的吞噬作用和细胞因子释放，而LPS则阻断这一过程。上述研究均表明，LPS介导的免疫耐受和BG介导的TI均与特定的表观遗传修饰改变有关，且发生了相反的改变。

1.2 LPS或BG介导的转录组学改变 通过对单核细胞转录组学进行分析，发现约5 700个mRNA在LPS和BG暴露下发生了动态变化［22］。与对照组相比，BG刺激后可促进与脂质合成、代谢和溶酶体途径有关的mRNA表达，如早期生长反应蛋白2（early growth response protein 2，EGR2）、巨噬细胞集落刺激因子1（CSF1）、溶酶体相关膜蛋白-1（LAMP1）、小眼畸形相关转录因子（MITF）等，单核细胞表达分化基因增快。与之相反，LPS刺激后，上述mRNA表达下调，单核细胞表达分化基因减慢，因而较少分化为巨噬细胞。提示BG刺激后可促进单核细胞分化为巨噬细胞，增强吞噬清除病原体的能力；而LPS刺激后，单核细胞产生免疫耐受，进而较少分化为巨噬细胞，抑制其吞噬功能。

2 调节免疫耐受和TI的代谢改变

2.1 EGR2免疫细胞代谢的改变可对早期细胞因子的释放、免疫耐受的形成及最终形成免疫麻痹产生重要影响［23-26］。EGR2是BG受体dictin-1的下游分子，其修饰的增强子主要与脂质代谢有关［27］。将人体外周血单核细胞（peripheral blood monocytes，PBMC）分别暴露于BG和LPS中24 h，静置5 d后发现，暴露于BG的单核细胞可短暂激活EGR2，EGR2的表达量升高，H3K27ac在相关增强子中沉积增多，相应的下游脂质代谢基因表达升高；而暴露于LPS的单核细胞并未发现有类似的作用，其下游代谢基因表达较低［22］。提示BG/dectin-1引起的EGR2激活可促进下游转录因子高表达，上调与脂质代谢相关基因的启动子和增强子表达。而这些转录因子在LPS暴露的单核细胞中不表达，说明暴露于LPS的单核细胞无法激活与脂质代谢相关的特异性下游通路。综上，dictin-1-EGR2通路在免疫训练和免疫耐受的单核细胞中的表达截然相反，说明其可能与TI或免疫耐受的形成有关，且在其中发挥完全相反的作用。

2.2 mTOR通过对BG引起的TI细胞进行转录组分析发现，在基因组蛋白修饰过程中，除了脂质代谢通路改变，其他重要细胞代谢通路如葡萄糖也发生了重要改变［28-30］。BG诱导的TI细胞有氧糖酵解增强，基础呼吸效率降低，葡萄糖消耗增多，乳酸形成增多。提高的糖酵解水平可调控组蛋白的甲基化和乙酰化，作为BG引起TI的代谢学基础。

雷帕霉素靶向基因（mammalian target of rapa‑mycin，mTOR）的表达在BG或LPS引起的免疫改变过程中均发挥巨大的作用。有研究表明，mTOR-缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α，mTOR-HIF-1α）通路对BG引起的TI细胞糖代谢改变至关重要。阻断mTOR-HIF-1α通路可抑制TI形成。给予小鼠mTOR抑制剂或敲除小鼠的HIF-1α，则无法产生TI以应对病原体的二次入侵［17］。还有研究表明，LPS引起的免疫耐受中也发现了mTOR表达的改变。mTOR对巨噬细胞的吞噬作用和极化均有重要作用［31-32］。M1型巨噬细胞可分泌大量细胞因子，激活机体免疫反应，促进炎症反应；而M2型巨噬细胞具有抗炎、抑制细胞因子释放、抑制免疫应答的作用［33］。激活mTOR可促进巨噬细胞极化为M2型。给予mTOR抑制剂雷帕霉素后，巨噬细胞主要极化为M1型。由此说明，在TI和免疫耐受中，这些看似无特殊作用的代谢产物可通过改变基因相关酶的活性来修饰表观遗传。

2.3 衣康酸盐 衣康酸盐是三羧酸循环（tricarbox‑ylic acid cycle，TCA）中顺乌头酸在免疫反应基因1（immune-responsive gene 1，IRG1）的调节下由乌头酸脱氢酶1（aconitate decarboxylase 1，Acod1）催化产生。脓毒症时，髓样细胞急剧激活可导致衣康酸盐大量产生，进而介导人单核细胞产生固有免疫耐受［34-36］。

大量研究成果表明，衣康酸盐作为主要代谢产物，通过调节琥珀酸脱氢酶（succinate dehydroge‑nase，SDH）的表达以及TCA循环体在LPS或BG介导的免疫改变过程中发挥巨大作用［37-39］。LPS刺激后，衣康酸盐是巨噬细胞中上调最明显的代谢产物。巨噬细胞内急剧升高的衣康酸盐一方面可抑制SDH，调节琥珀酸和延胡索酸水平，抵消琥珀酸的促炎作用；另一方面可激活Nrf2，上调抗炎抗氧化基因表达，抑制炎症基因表达，抑制细胞因子IL-1β、IL-18、IL-6、IL-12、NO和HIF-1α表达，进而产生抗炎作用，介导单核/巨噬细胞产生免疫耐受［40］。而BG引起的TI可通过下调IRG1表达，上调SD的表达，进而抑制衣康酸盐的产生，恢复TCA循环，使机体面对二次感染时产生更强的固有免疫反应。为进一步探究其表观遗传改变，将PBMC分别给予LPS或BG刺激后，研究者们通过检测H3K27ac水平发现，LPS可引起IRG1周围大量的H3K27乙酰化。且H3K27ac的动态变化与IRG1的高表达曲线一致。当受到LPS和BG混合刺激或在LPS刺激前暴露于BG，巨噬细胞IRG1含量仅轻度升高，说明BG可抑制LPS引起的IRG1高表达，进而阻断衣康酸盐的形成。LPS刺激后4 h细胞处于耐受状态，SDH表达下调，进而影响琥珀酸和延胡索酸间的代谢转换，阻断琥珀酸激活的促炎通路，影响体外单核细胞分化。而在LPS刺激后给予BG可恢复SDH表达的上调。即BG可逆转LPS导致的单核细胞SDH表达下调，恢复SDH表达［41］。由此可知，IRG1-衣康酸盐-SDH轴在LPS引起的单核细胞免疫耐受中发挥重要作用，BG或可逆转LPS造成的免疫耐受。

3 BG可逆转脓毒症后免疫耐受

BG和LPS暴露对组蛋白标记H3K4me3、H3K4me1、H3K27ac在目标启动子和增强子的沉积、转录组的变化、EGR2及下游转录因子表达、mTORHIF-1α通路的激活、TCA中衣康酸盐的产生有完全相反的影响，进而对与单核/巨噬细胞功能有关的基因的表达、代谢通路如糖代谢及细胞因子的产生发生截然不同的调节，提示BG或可逆转免疫耐受。将单核细胞暴露于LPS 24 h诱发免疫耐受后再暴露于BG 24 h，经历一段不打扰时间后再次暴露于LPS，探索BG对LPS诱发的免疫耐受的作用。结果发现，LPS耐受后给予BG可恢复约60%的耐受基因表达，包括一些促炎的TFs，部分恢复单核细胞释放细胞因子的水平［16］。为进一步确定其疗效，在人体实验中，健康志愿者注射LPS后4 h，关键细胞因子如IL-6和TNF-α的mRNA表达增多，细胞因子释放增多。抽取志愿者外周血，再次暴露于LPS，则无细胞因子释放［22］。说明单核细胞产生了耐受。而事先给予BG，可恢复炎症因子IL-6和TNF-α的释放，解除单核细胞的耐受。上述研究在细胞和人体水平证明了，LPS在体内外引起耐受的机制相同，BG逆转LPS引起的免疫耐受的潜能或可被推广到临床。

4 展望

脓毒症的死亡率在30%～50%，且因耐药性严重、老年人口增多和免疫抑制的发生率升高，脓毒症的死亡率也逐年升高［42］。如何逆转脓毒症后的免疫耐受成了国内外研究的热点。

表观遗传学分析发现，早期暴露于病原体时，免疫耐受和TI可对常见通路如IRG1-衣康酸盐-SDH轴产生完全相反的调节，产生不同的表观遗传改变，形成不同的巨噬细胞表型和免疫功能状态。免疫耐受表现为低免疫反应状态，而TI表现为高免疫反应，产生更多的细胞因子。鉴于二者存在相反的表观遗传改变和单核/巨噬细胞功能状态，研究者或许可将BG引起的TI作为治疗免疫耐受靶点。近年来，DNA剪切技术的飞速发展也为研究者明确对BG反应最明显的转录因子、表观遗传因子和DNA甲基化片段提供了帮助。为研究者确定治疗靶点，尽快将BG应用于临床提供助力。除了免疫耐受的研究，也可将BG引起的TI用于其他临床疾病，如肿瘤、自身免疫疾病和自身炎症反应等。

免疫领域还有很多问题值得深思。研究者需要进一步阐述影响TI和免疫耐受的代谢和表观遗传过程，探讨TI和免疫耐受之间的复杂关系。随着科学的进展，BG引起的训练免疫和LPS引起的免疫耐受的具体机制正在被逐步明确，单核细胞作为固有免疫的重要组成部分，与免疫耐受和TI密切相关，但其他固有免疫成分，如补体系统、溶菌酶是否也会在TI和免疫耐受的代谢和表观遗传过程中发挥作用，TI和免疫耐受之间依靠哪些机制相互调节转换等问题都需要进一步探究。