血清KL-6、DD及CRP在ANCA相关性血管炎合并间质性肺病检测中的临床价值①

谭立明 卢晓霞 张 倩 黄家翌 宫阳阳 张皓承 刘宇晗 余建林

（南昌大学第二附属医院，南昌 330006）

抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎（antineutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis，ANCA-associated vasculitis，AAV）是一类以血清AN‑CA检测阳性和中小型血管炎症为特征的慢性自身免疫性疾病，主要包括显微镜下多血管炎、肉芽肿性多血管炎和嗜酸性肉芽肿性多血管炎三种类型，主要影响肾、肺和其他器官［1-2］。最新研究表明AAV患者的标准化死亡率是健康人的2.7倍［3］。AAV合并间质性肺病（interstitial lung disease，ILD）在临床上较为常见，诊断方法主要为病史分析、临床检查、影像学分析和ANCA检测，但由于检查存在不良反应或费用较高等，不易被一般患者所接受。研究表明，血清Ⅱ型肺泡细胞表面抗原（krebs von den-lun‑gen-6，KL-6）在结缔组织病（connective tissue dis‑ease，CTD）合并ILD中高表达，可以反映ILD的活动程度［4］；D-二聚体（D-dimer，DD）为凝血指标，在活动期的AAV中高表达，且与ILD的发生密切相关［5-6］；C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）为炎症指标，与AAV的活动性相关。本研究选取南昌大学第二附属医院45例AAV-ILD患者、42例AAV患者和40例健康体检者作为研究对象，旨在探究血清KL-6、DD及CRP检测对AAV-ILD的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象 选取南昌大学第二附属医院2015年5月至2019年7月确诊的45例AAV-ILD患者，42例AAV患者，40例健康体检者。AAV的诊断符合2012年美国Chapel Hill Consensus Conference关于ANCA相关性血管炎的诊断标准［7］；ILD确诊条件：①临床表现有渐进性气促、干咳、活动性呼吸困难，肺部听诊有散在或弥漫的湿啰音；②肺功能检查表现出不同程度的弥散量减少及限制性通气功能障碍；③肺部高分辨率CT（high-resolution CT，HRCT）有下列影像学变化，如肺内呈现不规则线条网格样改变、双下肺外侧出现蜂窝影、小叶间隔增厚、磨玻璃影等多种表现。研究对象均知情同意，并且本研究获得南昌大学第二附属医院伦理委员会批准许可。

1.1.2 纳入标准 ①所有患者知情并同意本研究；②患者诊断明确，临床资料详实；③所有健康体检者的临床表现、病理、影像学及实验室血清学检查均无异常变化。

1.1.3 排除标准 ①继发性血管炎；②合并其他肺疾病，如：肺结核、肺部感染、支气管扩张及肺部肿瘤等；③合并其他自身免疫性疾病；④合并心、脑、肝、肾及血液系统等严重疾病；⑤合并肝炎、艾滋病等传染性疾病；⑥妊娠或哺乳期妇女。

1.1.4 试剂和仪器

1.1.4.1 KL-6的检测试剂由日本积水医疗科技（中国北京）有限公司提供，仪器为AU5400全自动生化分析仪。

1.1.4.2 DD的检测试剂由日本积水医疗科技（中国北京）有限公司提供，仪器为全自动血凝分析仪Sysmex CS-5100。

1.1.4.3 CRP的检测由美国贝克曼公司提供的IM‑MAGE 800型全自动特定蛋白分析系统及配套试剂完成。

1.1.4.4 ANCA的检测试剂由德国欧蒙医学实验诊断股份有限公司提供，EUPOStarⅢPlus荧光显微镜由德国EVROIMMUN公司提供。

1.1.4.5 抗髓过氧化物酶抗体（MPO）和抗蛋白酶3抗体（PR3）的检测试剂盒由欧根泰克诊断股份有限公司生产，仪器为KHBST-360酶标仪(上海科华生物工程股份有限公司)、PW-960全自动洗板机[记忆科技(深圳)有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 血样采集 所有研究对象空腹采3.0 ml外周静脉血2份，一份置于枸橼酸钠抗凝管中并摇晃均匀，2 500 r/min离心15 min，用于检测DD浓度；一份置于非抗凝管中静置30 min后，2 500 r/min离心15 min，用于检测KL-6和CRP浓度及ANCA。

1.2.2 KL-6的检测 操作步骤：输入样品号，输入预先设置的项目组合号，选择检测项目KL-6，输入对应样品号所做的项目信息，将样品架放入进样轨道，点击开始。所有操作均严格遵循试剂说明书及南昌大学第二附属医院质量管理标准。

1.2.3 DD的检测 操作步骤：输入样本号，选择检测项目DD，将样品架放入进样轨道，点击开始。所有操作均严格遵循试剂说明书及南昌大学第二附属医院质量管理标准。

1.2.4 CRP的检测 采用速率散射比浊法测定CRP，操作步骤：输入样本识别，确定架号和样本号，选择检测项目CRP及样本类型，保存设置，点击开始。以上所有操作均严格遵循试剂说明书及南昌大学第二附属医院质量管理标准。

1.2.5 ANCA的检测

1.2.5.1 采用间接免疫荧光法测定ANCA操作步骤：将患者稀释的血清与生物载片（反应区内固定有包被基质的生物薄片）温育30 min后进行冲洗，再加入荧光素标记的抗人抗体温育30 min，冲洗后进行封片，最后于显微镜下观察荧光模型。实验中建立质量控制，每分析批使用试剂盒中匹配的阴阳性对照物进行检测，同时使用自制的弱阳性质控物进行检测。

1.2.5.2 采用ELISA测定MPO和PR3操作步骤：将质控品和稀释的患者血清分别加入包被过氧化物酶和蛋白酶3的微孔板中，加速仪内温育15 min后洗液洗板3次，加辣根过氧化物酶标记的多克隆抗人IgG类抗体，加速仪内温育7.5 min，洗板5次，加底物后加速仪内避光温育7.5 min，加终止液，30 min之内用450 nm波长比色，计算结果。以上所有操作均严格遵循各试剂说明书及南昌大学第二附属医院质量管理标准。

1.3 统计学处理 数据分析采用SPSS24.0统计学软件。首先对数据进行正态性检验，正态分布资料以±s表示，比较前采用Levene's Test进行方差齐性检验，方差齐性的两两比较采用两独立样本t检验，方差不齐的两两比较采用t'检验；计数资料以例数（n）或率（%）表示，比较用χ2检验；根据统计数据绘制受试者工作特征（receiver operating characteris‑tic，ROC）曲线，计算ROC曲线下面积（area under the curve，AUC），AUC在0.5～0.7有较低诊断准确性，AUC在0.7～0.9有一定诊断准确性，AUC＞0.9有较高诊断准确性，当P＜0.05时差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组一般资料比较AAV-ILD组年龄36～85岁，平均（63.29±14.37）岁，AAV组年龄20～88岁，平均（58.12±15.74）岁，健康对照组年龄18～85岁，平均（53.63±18.36）岁，3组的平均年龄比较，差异无统计学意义（F=2.775，P=0.066）；AAV-ILD组男女比例为1∶0.55，AAV组男女比例为1∶1.1，健康对照组男女比例为1∶1，3组比较，差异无统计学意义（χ2=2.920，P=0.232），详见表1。

表1 各组患者临床特征的比较Tab.1 Comparison of clinical features of patients in each group

2.2 血清KL-6、DD及CRP检测水平比较AAVILD组患者血清KL-6和CRP水平与AAV组和健康对照组比较，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）；血清DD水平与AAV组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），与健康对照组比较，差异具有显著统计学意义（P＜0.01），详见表2。

表2 血清KL-6、DD及CRP检测水平比较（±s）Tab.2 Comparison of serum KL-6，DD and CRP levels（±s）

表2 血清KL-6、DD及CRP检测水平比较（±s）Tab.2 Comparison of serum KL-6，DD and CRP levels（±s）

Note：Compared with AAV and control group，1）P＜0.01；compared with AAV，2）P＜0.05；compared with control group，3）P＜0.01.

n Groups AAV-ILD AAV Control CRP（mg/L）78.01±37.721）51.41±28.943）6.90±3.39 45 42 40 KL-6（U/ml）715.95±265.991）266.48±101.14 251.11±98.14 DD（µg/ml）4.88±3.032）3.61±2.133）0.30±0.13

2.3 血清ANCA检测结果比较AAV-ILD和AAV组的p-ANCA、c-ANCA阳性率均大于健康对照组，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）；AAV-ILD和AAV组内，p-ANCA阳性率均大于c-ANCA阳性率，差异具有显著统计学意义（P＜0.01），详见表3。

表3 血清ANCA检测结果比较［例（%）］Tab.3 Comparison of test results of serum ANCA［n（%）］

2.4 血清KL-6、DD及CRP的诊断效能KL-6的灵敏度和特异度都很高；DD的灵敏度最高，但特异度很低；CRP的灵敏度较高，特异度一般，详见表4。

表4 血清KL-6、DD及CRP的诊断效能比较Tab.4 Comparison of diagnostic efficacy of serum KL-6，DD and CRP

2.5 血清KL-6、DD及CRP的ROC曲线分析 根据3组患者血清KL-6、DD及CRP水平计算出ROC曲线参数，绘制ROC曲线，其中KL-6对AAV-ILD的诊断价值最高，详见表5和图1。

表5 标志物的ROC曲线参数Tab.5 Parameters of biomarker′s ROC curves

2.6 各血清标志物的联合检测 将检测指标联合，进行串并联分析，计算联合后诊断AAV-ILD的敏感度和特异度。串联检测可显著提高诊断特异度，其中KL-6+DD+CRP串联时最高，为0.995；并联检测可显著提高诊断敏感度，其中KL-6+DD+CRP并联时最高，为0.999。所以联合检测对AAV-ILD诊断意义更大，详见表6。

图1 血清KL-6、DD及CRP的ROC曲线Fig.1 ROC curves of serum KL-6，DD and CRP

表6 各血清标志物的联合检测（%）Tab.6 Joint detection of serum markers（%）

3 讨论

AAV是一种严重的自身免疫性疾病，主要影响中小型血管且常累及其他器官。AAV的临床表现多种多样，从最初的皮疹可发展到多系统疾病，往往导致诊断上的明显延迟［8］。ILD是AAV常见的并发症之一，合并ILD的AAV患者病死率较高，早期诊断对于治疗和预后有重要意义。目前，HRCT是AAV-ILD诊断的重要手段，但难以做到早期诊断和检测病情的变化。因此，寻找诊断价值高的实验室指标尤为重要。

KL-6是日本人KOHNO等［9］于1985年发现并命名的高分子量（200 kD）糖蛋白，由MUC1基因编码，主要在Ⅱ型肺泡细胞表面表达，肺泡上皮细胞受破坏后会导致血清中KL-6的水平升高，因此KL-6可鉴别诊断各种慢性肺纤维化和肺泡蛋白沉积，目前已有研究报道KL-6为诊断ILD、评估病情严重程度和预后的一种有效的生物标志物［10-14］；DD来源于纤溶性交联纤维蛋白凝块，主要用于排除肺动脉栓塞和辅助诊断急性主动脉夹层，其含量在AAV的活动期患者中显著高于缓解期，对AAV-ILD患者的诊断价值研究尚少［15-16］；CRP是全身性炎症反应的标志物，可反映AAV的病情活动程度，在大部分AAVILD患者中显著升高，但属非特异性指标，其对AAV-ILD的诊断价值少有研究。

本研究发现，AAV-ILD组血清KL-6水平明显高于AAV组和健康对照组，差异具有统计学意义（P＜0.01），AAV组KL-6水平和健康对照组相比差异无统计学意义，这与YASUNORI IWATA等［17］的研究结果相似，说明AAV-ILD患者血清中KL-6水平的升高与AAV无关，而是由并发的ILD造成。本研究还发现AAV-ILD组血清DD及CRP水平高于AAV组和健康对照组，且AAV组高于健康对照组，差异具有统计学意义（P＜0.01）。以上研究结果提示KL-6、DD及CRP可作为辅助诊断AAV-ILD的血清学指标，经分析得出三者单独检测时的诊断效能，发现KL-6的敏感度为0.844，特异度为0.963，具有最大的诊断价值；DD和CRP的灵敏度均较高，但特异度比较低，DD的特异度仅为0.524，表明二者单独检测时诊断价值不大。

ANCAs是一组针对中性粒细胞和单核细胞胞浆成分的抗体，是诊断AAV的重要血清学指标，主要分为核周型（p-ANCA）和胞质型（c-ANCA）。本研究中，AAV-ILD组的ANCA阳性率显著高于健康对照组，与AAV组ANCA阳性率无统计学差异，说明AAV并发ILD对ANCA结果没有显著影响，同时也提示ANCA不是辅助诊断AAV-ILD的血清学指标。此外，AAV-ILD和AAV组内p-ANCA阳性率均高于c-ANCA，差异具有显著统计学意义（P＜0.01），这与NISHKANTHA ARULKUMARAN等［18］的研究结果相似，说明AAV并发ILD之后对ANCA的阳性类别没有显著影响。

通过比较血清KL-6、DD及CRP单独检测时ROC曲线下面积，发现KL-6的曲线下面积最大，为0.932，说明其具有很高的诊断价值，这是因为KL-6主要在Ⅱ型肺泡细胞表面表达，当肺组织受到损伤时，血清中KL-6水平升高，而AAV组和健康对照组的肺组织并未受到损伤，血清KL-6水平基本不会升高［19］。联合检测时，KL-6+DD+CRP串联检测的特异度最高，为0.995；并联检测的灵敏度最高，为0.999，表明联合检测的辅助诊断价值明显优于单独检测。此外，KL-6+DD和KL-6+CRP串联检测的特异度较高，KL-6+DD、KL-6+CRP和DD+CRP并联检测时的灵敏度均较高，因此在临床工作中，需要根据具体情况选择合适的检测方法。

综上所述，血清KL-6、DD及CRP这3项指标在AAV-ILD患者中高表达，单独检测KL-6具有较高的诊断价值，三者联合检测可显著提高AAV-ILD辅助诊断的诊断效能、灵敏度和特异度，具有较大的临床价值。