血浆miR-150及miR-200在系统性红斑狼疮患者中的表达及其临床意义

肖 华 卓 芬 黄娟娟（三亚中心医院检验科，三亚 572000）

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种多发于青年女性的自身免疫介导的经典的结缔组织病，累及皮肤、浆膜、关节、肾及中枢神经系统等，可导致患者多系统损害［1］。传统实验室指标，如抗双链DNA（dsDNA）抗体，补体C3、C4、血沉（ESR）及C反应蛋白（CRP）等，灵敏度和特异度不高，且其检测结果影响因素较多，尚不能成为诊断SLE的最佳标志物。因而，寻找能够在SLE患者体内特异表达的生物标志物，对SLE的辅助诊断及病情评估尤为重要。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一类长度在21～25 nt的非编码RNA，通过促进细胞活化、分化、凋亡、代谢及信号传导等机制调节机体免疫功能和炎症反应状态，从而在SLE的发生发展中发挥重要作用［2-3］。近年来研究发现，miR-150及miR-200通过调节免疫细胞分化与信号传导等过程，参与自身免疫疾病的病理生理过程，可能作为潜在的生物标志物［4-5］。本研究通过检测SLE患者 血浆miR-150及miR-200表 达 水平，分析miR-150及miR-200对SLE的诊断价值，旨在为SLE的诊断及靶向治疗提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料 选取2017年1月1日至2019年6月30日海南省第三人民医院收治的SLE患者120例，其中男性18例，女性102例，年龄19～64岁，平均（36.20±8.74）岁。采用SLE病情活动指数（sys‑temic lupus erythematosus disease activity index，SLE‑DAI）评分评估疾病活动度，其中低活动组56例（SLEDAI评分＜9分），高活动组64例（SLEDAI评分≥9分）。纳入标准：①SLE的诊断参考美国风湿病学会（American College of Rheumatology，ACR）2009年修订的SLE分类标准；②临床试验室资料完整，能配合本次研究者。排除标准：①合并急性或慢性炎症疾病、急性肾损伤、恶性肿瘤、血液系统疾病、严重心、脑、肾等原发性疾病及其他自身免疫性疾病者；②近1个月内服用过免疫抑制剂、激素及妊娠、哺乳期妇女。另选取50例健康志愿者作为对照组，其中男性11例，女性39例，年龄18～63岁，平均（35.70±9.28）岁。本研究经我院伦理委员会批准，并与患者或家属签署知情同意书。

1.1.2 主要试剂与仪器RNA提取试剂盒购自美国Ambio公司；ELISA检测试剂购自上海科新生物技术股份有限公司。实验引物由广东锐博公司合成。miR-150引物：正向引物5'-ACAGTCGTCATCAGTGT‑GCT-3'，反向引物5'-GAGTCTAGGGTCGTAGAC-3'；miR-200引物：正向引物5'-GTCAGCTAACTGACT‑GCTCG-3'，反向引物5'-ATGTACACTGAATAGTCG-3'；U6：正向引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。ABI 7500型荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR检测 所有研究对象均抽取空腹静脉血3 ml置于EDTA抗凝管，离心分离血浆，-80℃低温冰箱保存待测。试剂盒提取RNA，实时荧光定量PCR（real time PCR，RT-PCR）检测。以U6为内参，miRNA逆转录反应体系：5µl RNA模板，3µl U6及miRNA特异性茎环引物，0.15µl 100 mmol/L的脱氧核糖核苷酸（dNTPs），1.00µl逆转录酶（50 U/µl），1.50µl 10×反转录缓冲液，0.19µl RNase抑制剂（20 U/µl），4.16µl无菌三蒸水。PCR总反应体系为15µl，反应条件：16℃30 min、42℃30 min、85℃5min。以U6为实验内参，反应体系为20µl：1µl引物及探针Mix（20×），10µl TaqMan通用混合物溶液（2×），1.33µl反转录产物cDNA，7.67µl无核酸酶水。扩增条件为：95℃10 min 1个循环，95℃15 s、60℃60 s进行45个循环，实验重复3次。每个反应体系中荧光信号达到所设定的阈值经历的循环数即为Ct值，采用2-ΔΔCt法计算miR-150及miR-200表达水平，其中ΔCt=Ct目的基因-CtU6。

1.2.2 实验室相关指标检查ELISA法检测抗双链DNA（dsDNA）抗体含量，ESR使用魏氏法，血沉架手工检测；血清白蛋白（ALB）、补体C3、补体C4及CRP水平在贝克曼全自动生化分析仪上检测，操作过程均严格按照仪器及配套试剂说明书进行。

1.3 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件分析，计量资料以±s表示，多组间均数比较采用方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验；两独立样本均数比较采用成组t检验。计数资料以百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验。绘制受试者工作特征曲线分析血浆miR-150、miR-200及抗dsDNA抗体水平对SLE的诊断价值，曲线下面积（area under curve，AUC）的比较采用Z检验。相关性分析采用Pearson相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组一般资料及实验室指标比较SLE组、高活动组和低活动组抗dsDNA抗体、ESR及CRP水平均明显高于对照组（P＜0.05），且高活动组SLEDAI评分、抗dsDNA抗体水平均明显高于低活动组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。SLE组、高活动组和低活动组C3、C4及ALB水平均明显低于对照组（P＜0.05），且高活动组ALB水平明显低于低活动组（P＜0.05）；而高活动组和低活动组ESR、C3、C4及CRP水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）各组间性别、年龄及体质指数比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组一般资料及实验室指标比较（±s）Tab.1 Comparison of general data and laboratory indexes of each group（±s）

表1 各组一般资料及实验室指标比较（±s）Tab.1 Comparison of general data and laboratory indexes of each group（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.01；compared with low activity group，2）P＜0.01.

CRP（mg/L）3.25±1.06 10.72±4.281）13.90±5.271）12.62±4.511）3.850 0.020 Groups n Control Low activity High activity SLE 50 56 64 120 F P Male/female 11/39 7/49 11/53 18/102 0.352 0.518 Age（years）35.70±9.28 35.84±8.36 36.50±9.13 36.20±8.74 0.728 0.436 SLEDAI score-7.40±1.90 13.25±4.361）2）10.62±3.24 9.714＜0.01 Anti dsDNA antibody（U/ml）33.75±5.84 240.36±57.201）308.42±71.601）2）280.74±63.501）10.260＜0.001 ESR（mm/h）8.40±2.70 38.64±9.151）42.35±11.731）40.72±9.831）3.586 0.037 C3（g/L）1.16±0.35 0.68±0.241）0.63±0.211）0.65±0.201）4.217 0.012 C4（g/L）0.38±0.14 0.19±0.101）0.16±0.071）0.17±0.081）3.815 0.024 ALB（g/L）48.26±7.93 34.60±6.451）26.84±5.711）2）30.17±5.831）6.193＜0.001

2.2 各组血浆miR-150及miR-200表达水平比较SLE组、高活动组和低活动组血浆miR-150及miR-200表达水平均明显低于对照组（P＜0.01），且高活动组血浆miR-150及miR-200表达水平明显低于低活动组，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 各组血浆miR-150及miR-200表达水平比较（±s）Tab.2 Comparison of expression levels of miR-150 and miR-200 in each group（±s）

表2 各组血浆miR-150及miR-200表达水平比较（±s）Tab.2 Comparison of expression levels of miR-150 and miR-200 in each group（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.01；compared with low ac‑tivity group，2）P＜0.01.

miR-200 2.27±0.56 1.34±0.201）0.52±0.061）2）0.91±0.181）11.825＜0.01 Groups Control Low activity High activity SLE n 50 56 64 120 F P miR-150 1.73±0.38 0.81±0.151）0.22±0.031）2）0.48±0.051）14.713＜0.01

2.3 血浆miR-150、miR-200及抗dsDNA抗体水平对SLE的诊断价值 血浆miR-150、miR-200及抗dsDNA抗体水平诊断SLE的最佳截断值分别为0.54、0.97、195.40 U/ml，三项联合诊断SLE的曲线下面积明显高于单项miR-150、miR-200及抗dsDNA抗体，差异有统计学意义（Z=4.215，4.903、5.174，P＜0.05），其敏感度和特异度为92.5%和86.3%。见表3和图1。

表3 血浆miR-150、miR-200及抗dsDNA抗体水平对SLE的诊断价值Tab.3 Diagnostic value of plasma miR-150，miR-200 and anti dsDNA antibody levels in SLE

图1 血浆miR-150、miR-200及抗dsDNA抗体水平诊断SLE的ROC曲线Fig.1 ROC curve of diagnosing SLE with plasma miR-150，miR-200 and anti dsDNA antibody levels

2.4 血浆miR-150及miR-200表达水平与实验室指标的相关性分析Pearson相关分析显示，SLE患者血浆miR-150及miR-200表达水平与SLEDAI评分、抗dsDNA抗体水平均呈负相关（P＜0.001），而血浆miR-150及miR-200表达水平与C3、C4、ALB及CRP水平均无明显相关（P＞0.05）。见表4。

表4 血浆miR-150及miR-200表达水平与实验室指标的相关性分析Tab.4 Analysis of the correlation between the expression level of miR-150 and miR-200 in plasma and labo-ratory indexes

3 讨论

miRNA是近年来广受关注的重要的基因表达调控因子，在免疫应答及炎症反应的信号传导过程中发挥重要作用。SLE的免疫发病机制与B细胞过度激活和特异性自身抗体产生有关，而miRNA的表达水平与外周B细胞分布改变有关，其通过对免疫细胞分化与信号传导等过程调节激活B细胞表达，从而参与SLE的发生发展［6］。在SLE患者中，某些miRNA异常表达导致其调节的多个靶蛋白异常累积，导致活化信号的级联放大，从而参与SLE的发病过程，改变SLE患者体内miRNA表达水平可作为潜在的治疗手段［7］。miR-150分布于B、T细胞，目标基因是转录因子c-myb，功能是抑制B、T细胞的活性和增生，在B细胞中，miR-150导致c-myb水平降低，并阻止B细胞成熟，在SLE患者中表达下降，与SLE活动度呈负相关［8］。miR-200作为转录后的调节因子，能够调控细胞活动各个阶段，从分裂到增生到凋亡，可通过影响DNA甲基化及TLR信号通道等多个环节调控各种免疫细胞亚群分化及功能，在SLE的发病过程中发挥关键作用［9］。

本研究显示，SLE组、高活动组和低活动组抗dsDNA抗体水平均明显高于对照组，且高活动组SLEDAI评分、抗dsDNA抗体水平均明显高于低活动组，而SLE组、高活动组和低活动组血浆miR-150及miR-200表达水平均明显低于对照组，且高活动组血浆miR-150及miR-200表达水平明显低于低活动组。提示miR-150及miR-200在SLE患者中异常低表达，且与SLE活动度相关，其水平降低可能预示疾病活动度较高。相关分析也显示，SLE患者血浆miR-150及miR-200表达水平与SLEDAI评分呈负相关，进一步提示血浆miR-150及miR-200表达水平与SLE患者病情恶化有关，可能作为监测SLE患者病情的参考指标。REKVIG等［10］研究显示，抗ds‑DNA抗体在SLE患者中高表达，其对诊断SLE有一定的价值，与SLE的活动度相关，并可作为SLE疗效评估的参考指标。WANG等［11］研究发现，SLE患者miR-200水平明显低于健康对照组，与SLEDAI评分呈负相关，可能参与SLE的发病机制，未来有望作为SLE的生物标志物。本研究应用ROC曲线分析，血浆miR-150、miR-200及抗dsDNA抗体水平诊断SLE的最佳截断值分别为0.54、0.97、195.40 U/ml，三项联合诊断SLE的曲线下面积最大，其敏感度和特异度较好。说明miR-150、miR-200及抗dsDNA抗体三项联合检测有助于提高诊断SLE的准确性。相关分析也显示，SLE患者血浆miR-150、miR-200表达水平与抗dsDNA抗体水平呈负相关，进一步提示三项联合检测对诊断SLE具有较高的临床价值。NAKHJAVANI等［12］研究显示，与健康对照组相比，狼疮性肾炎患者血浆miR-150表达水平显著降低，参与了肾纤维化的发生，可能作为诊断狼疮性肾炎的潜在生物标志物。ZHANG等［13］研究发现，与健康对照组相比，狼疮性肾炎患者血浆miR-200表达水平降低，与SLEDAI评分呈负相关，且miR-200表达升高是预测狼疮性肾炎发病的独立保护因子，可作为狼疮性肾炎诊断的新型标志物。LI等［14］研究认为，SLE患者血清miR-203水平明显降低，与抗dsD‑NA抗体和SLEDAI评分相关，对SLE的鉴别诊断和判断疾病活动度有一定价值。另有研究表明，SLE患者血浆miR-92a表达水平下调可能与其发病和病情进展相关，可以作为SLE临床诊断的新型生物学指标［15］。

综上所述，SLE患者血浆miR-150及miR-200表达水平明显降低，且与SLE病情活动度相关，联合抗dsDNA抗体检测对SLE诊断具有一定价值，同时也为了解SLE的发病机制提供了新的见解。但这些研究仍处于初步探索阶段，今后尚需更多研究进一步证实miR-150及miR-200在SLE中的临床应用价值，使其为临床提供更丰富的SLE诊疗体系。