基于骨细胞的骨稳态维持与骨缺损修复*

洪 乐， 李 鑫

（口腔疾病研究国家重点实验室，国家口腔疾病临床医学研究中心，四川大学华西口腔医院，四川成都610041）

1 骨细胞概述

骨细胞是骨骼系统中含量最丰富、分布最广泛的细胞，由成骨细胞分化而来，包埋于矿化的骨基质中，占成年人骨骼细胞的90%～95%，寿命可长达25年［1］。多年来研究者对骨细胞的生物学性质与功能知之甚少。随着骨细胞分离和体外培养技术的开发，人们对骨细胞的认知有了极大的拓展。从最早认为骨细胞是埋藏在矿化骨基质中静止的、不活跃的细胞［2］，到发现其机械应力转导和矿物质稳态维持功能［3］，再到近几年研究发现骨细胞的骨代谢调控作用［4］，骨细胞目前已成为骨生理和骨病理研究的热点。

骨组织的生理代谢过程大致可分为骨形成和骨改建两个阶段，个体生长发育期中以骨形成为主导，骨改建则贯穿整个生命周期。这两个阶段中均伴随生理性成骨过程［5］。成骨细胞经历胶原基质分泌、细胞嵌入、细胞突生成3 个阶段分化为骨细胞，所在位置被基质包埋而成为骨陷窝［6］；成熟骨细胞通过细胞突与其他骨细胞互相连接，形成最基本的骨细胞网格；随着基质分泌、矿化与包埋，细胞突周围形成骨小管，从而最终形成骨陷窝-骨小管网格系统（lacuno-canaliculi system，LCN）。据估计成人体内LCN 总面积可达到 201 m2［7］，每个组成 LCN 的骨细胞可伸出多达40～100 个细胞突。在皮质骨解剖中，骨细胞层叠环绕哈弗氏管而形成骨单位。LCN 及骨单位的存在令各类信号分子得以进行跨细胞移动，是骨细胞发挥功能的形态学与组织学基础［8］。虽然组织学上骨细胞与成骨细胞同源，二者基因选择性表达几近相同，但在表达水平上却呈现明显差异。例如，骨细胞中碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和I 型胶原蛋白（collagen type I，Col I）表达水平较低，而磷酸代谢和骨组织矿化相关基因如X 染色体内肽酶同源磷酸调节基因（phosphate regulating gene with homologies to endopeptidases on the X-chromosome，PHEX）、细胞外基质磷酸糖蛋白（matrix extracellular phosphoglycoprotein，MEPE）、特定成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）等的表达较高［6］。这也导致了骨细胞特有的功能机制。

2 骨细胞参与骨稳态维持

骨组织的动态代谢过程是由成骨细胞和破骨细胞共同协调的［4］，而骨细胞可与骨微环境中多种细胞发生交互作用，进而影响骨形成与骨吸收的动态平衡。骨细胞的数量和活性对骨组织正常生理功能的维持十分重要，其凋亡则与骨组织病理情况密切相关［6］。靶向消除骨细胞的转基因小鼠表现出成骨细胞功能障碍、骨小梁缺失、皮质空隙增加等脆性骨特征［9］。在新生小鼠体内利用原位末端转移酶标记DNA 片段分析发现，骨细胞凋亡小体的核因子κB 配体受体激活剂（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）表达与释放增加，进而作为破骨细胞招募与分化的信号［10］，影响局部骨改建从而参与骨发育进程。衰老小鼠中骨细胞的数目明显降低，且骨细胞凋亡通过诱导破骨细胞形成与招募从而调控衰老相关骨病理进程［11］。

在骨形成方面，骨细胞可以通过参与类骨基质的合成和矿化、合成骨形成与矿化相关蛋白质，如Col I、骨钙蛋白（osteocalcin，OCN）及ALP 等［4］，参与骨生成。骨细胞也可通过分泌骨桥蛋白（osteopontin，OPN）及OPN/CD4 介导通路，招募骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs），启动成骨分化与骨形成［4］；还可分泌骨硬化蛋白（sclerostin，SOST）。作为骨细胞特异性表达的分泌蛋白，SOST 在骨小管中广泛分布，主要通过拮抗骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）及竞争性结合低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6（lowdensity lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP5/6）两种调控方式［12］，阻断 Wnt 通路对成骨分化和骨形成的促进作用［13］。同时，骨细胞特异性高表达FGF2及FGF18［4］。当FGF2缺失时，成骨细胞数目显著减少、骨量下降；敲除FGF18则表现出骨骼延迟形成。FGF 通路与Wnt 通路的协同作用可解除Wnt 抑制从而促进成骨分化与骨形成［14］。

在骨吸收方面，骨细胞可分泌RANKL。RANKL和巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）是破骨细胞分化过程的关键因子［15］。M-CSF基因敲除小鼠表现出骨细胞缺陷与骨质疏松表型，这可能是由于M-CSF 对骨细胞存活和（或）分化的直接影响，或是破骨细胞和（或）巨噬细胞依赖性信号缺失的间接作用［15］。而RANKL可阻止破骨细胞凋亡，促进破骨细胞前体分化并增强成熟破骨细胞活性，从而调控破骨细胞的活化与功能［16］。骨细胞源性RANKL对骨稳态至关重要，有证据显示，纯化的骨细胞比成骨细胞或BMSCs更能通过释放RANKL刺激破骨细胞分化成熟［17］。在特定条件下，骨细胞也可模仿破骨细胞的功能，通过清除周围骨基质从而作为骨组织的一种保护机制［18］。值得注意的是，骨细胞可通过RANKL/OPG 轴调控骨吸收过程［19］。骨保护素（osteoprotegerin，OPG）可与 RANKL 相互拮抗［19］，阻止RANKL-RANK 间结合，因而RANKL/OPG 比值是决定破骨细胞介导的骨吸收在特定部位发生程度的关键因素。同时，骨细胞可通过分泌BMP 等与甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）、雌激素等其他外源性因子共同作用调节 RANKL/OPG 比例［20］，从而控制成骨-破骨的动态平衡。此外，在应力作用下，成熟骨细胞的胞内钙离子浓度随之发生改变进而通过信号通路调控引起相关生物学作用，提示骨细胞可通过机械感受机制直接参与调控骨稳态［21］。

3 骨细胞参与骨缺损进程

骨缺损泛指一整类由感染、创伤、肿瘤、骨髓炎清创及先天性疾病造成骨质缺失、间隙形成的疾病［22］。因诊断标准复杂、临床表现多样，学术上一般使用“临界骨缺损”（critical-sized bone defects，CSBD）或“大段骨缺损”（large/massive bone defects）描述长度超过2 cm或深度超过骨周径50%的骨体缺损［23-24］。有报道指出，外伤骨折患者中有0.4%（主要是粉碎性、开放性骨折）伴发临界骨缺损［25］，全球每年因颅面部临界骨缺损进行的骨移植术可超过100 万例［26］。此外，临界骨缺损还可继发休克、感染、各型骨不连及损伤性骨化等并发症［23-24，27-34］，严重影响患者健康及生存，为社会带来巨大的经济负担。骨缺损后骨细胞的病理变化主要包括3 个方面：首先，骨细胞网格状结构将逐渐发生细胞突的萎缩断裂、陷窝中细胞皱缩、细胞核染色性状改变等退行性变化，单个骨细胞的平均骨细胞小管数也明显减少［35-36］；其次，骨缺损后病灶区骨细胞内分泌功能减弱，而邻近健康骨细胞分泌功能增强［35］，提示骨缺损阻断了骨细胞间通讯［37］；此后，骨陷窝及骨小管中液体流速及成分发生变化，溶解氧减少，从而引起骨细胞凋亡并释放炎性细胞因子招募破骨细胞［36］；后期，病灶区骨细胞加速血管新生并进一步促进破骨细胞募集及骨重建［35］。在炎性骨缺损中，促炎性细胞因子的释放将加速骨细胞凋亡，从而加速上述进程［38］。成熟骨组织出现微小骨缺损后，骨细胞可通过旁分泌信号通路抑制破骨细胞活性［39］，并分泌肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）等炎症因子以加速骨修复［35］。

在不同的病理状态下，骨细胞可能参与骨折、炎性骨损伤和肿瘤骨转移的疾病进程。在骨质疏松导致的骨折率增加与骨折愈合延迟中，骨细胞中缝隙连接蛋白43（connexin 43，Cx43）基因突变的转基因小鼠骨折韧性降低且骨折风险增加，提示骨细胞对维持骨组织正常结构和机械完整性的重要作用［40］。在重度牙周炎引发的牙槽骨缺损中，牙周致病菌毒性产物脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可穿透牙槽骨直接刺激包埋其中的骨细胞，引起RANKL 阳性的骨细胞比例及RANKL 整体水平显著上调，从而引起牙槽骨炎性骨丢失。抑制骨细胞SOST的表达可诱导牙槽骨中牙周膜干细胞的成骨向分化产生类骨细胞并最终转化为骨，进而导致牙槽骨体积增加甚至逆转牙槽骨退化。肿瘤骨转移过程中转移癌细胞与靶骨组织骨微环境之间相互作用可引起骨组织的溶骨性或成骨性病变［13］。研究已表明，肿瘤骨转移过程中，在包括原发性肿瘤扩散、转移性肿瘤休眠、转移性肿瘤生长、肿瘤诱导成骨/溶骨的多个进程中，Wnt信号通路都起到重要作用［13］。例如，在间充质上皮转化过程中βcatenin 等的高参与度决定了其在原发性肿瘤扩散的重要地位［41］；同时，Wnt 通路可通过β-catenin 介导的经典途径或非经典途径直接调控肿瘤细胞的休眠行为［42］；转移性肿瘤生长时，Wnt3a 等分子可通过下游通路介导肿瘤细胞与骨微环境的交流从而支持肿瘤细胞生长［43］；而在肿瘤细胞诱导成骨/溶骨过程中，肿瘤细胞分泌的Wnt7b 等分子可破坏骨稳态从而引起骨组织损伤［44-45］。在肿瘤转移骨组织中，骨细胞的SOST 表达与分泌水平也可发现明显升高，表明骨细胞可能通过分泌SOST调控肿瘤细胞对骨组织的浸润与损伤［46］。研究还发现，肿瘤骨转移过程中骨细胞中表达的Cx43还可与乳腺癌细胞表达的Cx43形成异质细胞间隙来促进肿瘤细胞的迁移和入侵［47］。此外，在肿瘤骨转移晚期，骨细胞凋亡将加剧骨吸收与骨沉积失衡从而加速骨破坏［17］，严重影响患者生存质量。

4 靶向骨细胞调控骨代谢

骨细胞参与的 Wnt 通路［48］可与 BMP 通路［49］和Hedgehog 通路［50］交互作用，进而调控骨与软骨生成。在成骨调控中，Wnt 经典通路通过激活β 连环蛋白（β-catenin）进入细胞核内启动RUNX2基因活化，以此调节ALP、OCN、Col I 等的表达促进成骨分化。值得注意的是，在发育不同阶段，Wnt 通路对骨形成的调控有赖于不同的细胞类型。在发育早期［5，13］，Wnt/β-catenin 通路在BMSCs、成骨祖细胞及早期成骨细胞等高表达，敲除CTNNB1基因（编码β-catenin 的基因）将导致成骨细胞数量缺失，骨形成进程终止；而在成骨发育晚期，Wnt 对上述细胞的作用相对减弱，转而通过骨细胞对骨形成施加影响。将小鼠原代BMSCs 与原代骨细胞进行体外共培养发现，在成骨发育晚期激活骨细胞β-catenin可显著增强BMSCs的成骨向分化；体内激活骨细胞的Wnt 信号也可显著增加成骨细胞数量及骨量［5］，提示骨细胞的Wnt/βcatenin 通路对骨形成代谢有重要调控作用。近期研究也发现Wnt/β-catenin 通路在血管生成和免疫监视方面的调节作用［51］，针对性调控骨细胞Wnt 通路可能对骨稳态维持及骨缺损修复有重要意义。

骨细胞也可通过Wnt通路调节自身Notch配体的表达进而激活靶细胞如BMSCs的Notch通路［5］。典型的Notch 通路由受体、配体及DNA 结合因子组成，是进化上高度保守的信号通路。在卵巢去势的成年小鼠中，过表达Notch通路可促进包埋在基质中的骨细胞继续增殖分化，从而显著促进成骨［52］。Notch 通路也可通过下调SOST与Dickkopf-1（DKK1）的表达，正向调控 Wnt 通路［52］，也可通过 Smad 依赖的 BMP 信号通路协同上调OPG 表达水平，从而促进成骨细胞分化与骨形成，间接抑制破骨细胞分化与骨吸收。基于Rosa 转基因小鼠条件性诱导骨形成不同阶段Notch表达的研究发现，不同发育阶段对Notch通路在骨组织中的作用有重要影响。在未成熟的成骨细胞中抑制Notch 表达时，成骨分化进程将被阻止，导致骨质减少；而在骨细胞中抑制Notch 表达则可抑制骨吸收，增加骨体积［53］。因此，对骨细胞相关Notch通路的调控应注意骨组织所处环境对调控手段的影响。

靶向Wnt 通路抑制剂SOST 的骨损伤修复疗法近年来已颇有成效。2010 年SOST 单抗罗莫佐单抗（romosozumab/AMG785）率先在美国完成人体内临床试验［54］，并于 2019 年获 FDA 批准作为一种骨折高危绝经后女性的骨质疏松症治疗药物上市。骨细胞SOST的表达受机械应力刺激、失重、PTH、雌激素、胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）等的影响［12，55］，这可能为未来针对性调控骨细胞中 SOST表达与分泌的骨修复与再生策略提供一定参考。

5 结语

骨细胞虽然在骨骼系统中数量最多、分布最广，但研究进展却长期落后于同在骨组织中的成骨细胞和破骨细胞。近年来，骨细胞偶联成骨与破骨活动调控骨代谢的作用成为骨生理和骨病理研究的热点。骨细胞的独特形态学与生物学特性使其在生命进程早期的发育阶段乃至成年期生理与病理状态下的骨代谢中都发挥着重要作用。本文浅谈了骨细胞在骨稳态维持与骨缺损修复中的科研进展。值得注意的是，虽然当前靶向骨细胞的骨代谢调控策略的研究已取得一定进展，但基于此的实际临床转化应用仍十分匮乏。一些关键问题，如骨细胞的脱分化潜能、直接或间接的骨细胞功能调控方式、新型骨代谢调节因子或分子靶点的鉴别等，均需进一步的研究，以便为基于骨细胞的骨组织修复与再生策略提供科学依据。因此，对骨细胞在骨稳态和骨损伤中的调控作用及其机制的深入研究将有助于我们认识骨发育、损伤、修复和再生过程，为代谢性骨病的防治方法提供参考。