TLR4/NF-κB 参与动脉粥样硬化发生发展机制的研究进展

李嘉慧王欣佩冷 静

(1.广西医科大学基础医学院免疫学教研室,南宁 530021； 2.广西中医药大学,广西高发传染病中西医结合转化医学重点实验室,南宁 530200； 3.中国医学科学院医学实验动物研究所,北京协和医学院比较医学中心,北京 100021)

心血管疾病(cardiovascular diseases,CVD)是世界范围内死亡的主要原因。 据世界卫生组织(world health organization, WHO)统计,每年约有1790 万的人死于CVD,占全球死亡人数的31%,超过75%的CVD 发生在中低收入水平国家。 致CVD 的病因有多种,大多数CVD 的根本原因是动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)的发生[1]。

AS 的发病机制尚不清楚,然而某些因素能够增加AS 的发病概率,包括遗传、环境和个体习惯,如吸烟、肥胖、糖尿病、高血压等等[2]。

血脂升高是AS 发展的核心,近年来,越来越多的研究发现,慢性炎症在AS 发病机制中起着重要的作用[3-4]。 这种炎症信号与天然免疫和适应性免疫均有联系[5]。 固有免疫作为机体抵抗外来病原菌的第一道防线,近年来较多的研究其在AS 发病中的影响。 Toll 样受体(Toll-like receptor, TLR),TLR4 作为TLR 家族中的一员,通过激活下游炎性因子的分泌参与AS 从内膜脂质积聚到斑块破裂的各个阶段,因而被认为是影响AS 发生发展的重要靶点之一。

1 TLR4 的概述

1.1 TLR4 分布及分子结构

TLR 是一种重要的模式识别受体,通过识别各种病原相关分子模式(pathogen-associated molecule pattern,PAMP)在天然免疫中发挥重要的作用[6]。TLR4 是第一个发现的受体,分布于B 细胞、单核/巨噬细胞、平滑肌细胞、树突状细胞等细胞表面,能够识别广泛的危险信号分子,包括微生物成分,如脂多糖(LPS)和经过内源性修饰的分子,如氧化低密度脂蛋白(oxLDL)[7]。

TLR4 是一型跨膜蛋白,由胞外域、胞浆区和跨膜区三部分组成。 胞外域由亮氨酸富集的重复序列组成,参与对PAMP 的识别,通过跨膜区将信号转导入细胞内。 胞浆区因与IL-1R 家族成员的胞浆区高度同源,因此称为Toll/IL-1 受体(Toll/IL-1 receptor, TIR)结构域,用于募集含有TIR 结构域的衔接蛋白,进行下游的信号转导[8]。 Toll 样受体识别PAMP 在固有免疫中发挥作用,激活树突状细胞表达共刺激分子,将主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)二类分子携带的抗原表达于树突状细胞表面,T 细胞识别发挥适应性免疫应答,因此Toll 样受体在固有免疫和适应性免疫应答中发挥桥梁作用[9-10]。

1.2 TLR4 的两条信号传导通路

TLR4 识别配体发生在细胞表面,受体内化进行信号的传导。 TLR4 是唯一可以激活两条信号通路的TLR 受体:MyD88 依赖型信号通路和MyD88 非依赖型信号通路[11]。 分别由MyD88 和TRIF 两种衔接蛋白与受体结合激活下游信号,分别产生促炎细胞因子和干扰素,进而激活T、B 淋巴细胞介导的适应性免疫应答,进一步杀伤入侵的病原微生物[12]。

1.2.1 MyD88 依赖性信号通路

MyD88 依赖型信号通路是在质膜上介导除TLR3 以外所有TLR 的共同信号转导通路[13]。 髓样分化蛋白88 (myeloid differential proteiN-88,MyD88)是一种衔接蛋白,有两个特殊的结构域N端和C 端。 C 端含有TLR 结构域,其作用是募集受体激活信号通路。 N 端又称为死亡结构域,其与IL-1R 相关激酶4(IL-1R related kinases-4, IRAK-4)相互作用,IRAK-4 磷酸化IRAK-1,IRAK-1 进一步激活肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor-associated factor 6, TRAF6)[14]。 TRAF6 是一种E3 泛素连接酶,TRAF-6 与转化生长因子β 活化激酶-1(TAK1)相互作用,TAK1 与TAK1 结合蛋白1 和2(TAB1 和TAB2)结合后。 活化的TAK1 进一步激活NF-κB 抑制蛋白激酶复合物(IKK α、β、ε)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK),进而激活NF-κB 和AP-1 蛋白,激活后的转录因子进入细胞核,产生各种细胞因子和趋化因子,如白介素-6(interleukiN-6, IL-6)、白介素-1β(interleukiN-1β, IL-1β)、肿 瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、单核细胞趋化蛋白- 1 (monocyte chemoattractant proteiN-1, MCP-1)等[15-17]。

1.2.2 MyD88 非依赖性信号通路

MyD88 非依赖性信号通路是内体发生的另一条信号转导通路。 TLR4 通过衔接蛋白TRAM 与TRIF 结合后,激活TRIF,TRIF 与TRAF3、TRAF6 以及受体相互作用蛋白1 和3(RIP1、RIP3)结合后,TRAF3 和TRAF6 活化,分别行使不同的激活通路[18-19]:TRAF3 与IKKε 结合,活化干扰素调节因子3(interferon regulatory factor3, IRF3),一型干扰素(interferon, IFN)产生[20]；TRAF6 在RIP1 的作用下与TAK1 结合,激活NF-κB 和MAPK 诱导细胞因子的产生[12]。

2 TLR4/NF-κB 在动脉粥样硬化发展中的作用

TLR4 作为天然免疫TLR 家族中一员,它的上调及其下游通路的激活在AS 的发生中有着一定的地位。 TLR4 在人和小鼠的AS 过程中均有过表达,主要在病变的巨噬细胞和内皮细胞内,参与AS 的各个阶段[21]。 有研究发现,与C57BL/6 小鼠相比,C3H/HeJ 小鼠在高胆固醇和饮食中具有抗AS 的能力。 这是由于C3H/HeJ 小鼠在TLR4 细胞质区存在点突变,导致TLR4 无功能,因此TLR4 可能是小鼠体内发生AS 的一种重要因素[22]。 Michelsen等[23]人通过抑制TLR4 和MyD88 基因表达,显著降低Apo-e-/-小鼠主动脉粥样硬化病变面积、斑块脂质含量、巨噬细胞浸润、内皮细胞对白细胞的黏附及循环促炎细胞因子,如MCP-1、IL-12 等的循环水平。 Edfeldt 等[24]研究发现,TLR4 在人AS 的内皮细胞、动脉粥样斑块上表达高度上调,因此TLR4 在人AS 的形成过程中有着重要的作用。

2.1 TLR4 在脂肪条纹形成中的作用

AS 是由于脂肪、血栓等在血管内皮沉积的一种慢性血管疾病。 血管内皮具有抗炎、抗凝血的功能,在维持血管完整性方面有着重要的作用。 脂质代谢障碍是AS 的病变基础,它触发了由慢性炎症介导的免疫反应,导致血管内皮功能异常[25]。

血脂中的低密度脂蛋白与内皮细胞相互作用是AS 发生的开始。 美国心脏协会将血脂中的LDL增加到1.81～4.89 mmol/L 定义为高脂血症[26]。 由于血脂负荷,血脂中LDL 增加后,LDL 被摄入内膜修饰为ox-LDL。 oxLDL 可激活T 细胞,分泌细胞因子和黏附分子,使得单核细胞阻滞,与内皮细胞接触后形成巨噬细胞[27]。 oxLDL 的激活可促进巨噬细胞表面的TLR4 表达上调,促炎巨噬细胞吞噬脂质形成泡沫细胞,泡沫细胞的积累形成了脂肪条纹,是AS 的第一个标志。 Howell 等[28]人对TLR4活性和TLR4 缺陷的C3H/HeN 小鼠巨噬细胞体外进行oxLDL 诱导后,TLR4 活性的小鼠巨噬细胞分化为泡沫细胞的比例出现上调,此外,研究者在给予oxLDL 诱导前,用TLR4 单克隆抗体预处理C3H/HeN 小鼠巨噬细胞,巨噬细胞向泡沫细胞分化的比例从29%降到13%,因此他们认为TLR4 是oxLDL诱导巨噬细胞向泡沫细胞分化所必须的。 然而oxLDL 激活巨噬细胞表面TLR4 和引发的炎症反应的确切机制尚不清楚。 最新的一项研究表明髓样分化蛋白- 2 (myeloid differentiation protein 2,MD2),巨噬细胞表面的一种受体,在oxLDL 激活TLR4 中发挥着重要的作用,oxLDL 可直接与MD2结合,诱导巨噬细胞MD2/TLR4 复合物的形成和TLR4/MyD88/NF-κB 促炎级联而引起TLR4 激活触发炎症反应,并发现MD2 缺乏或抑制可以阻止AS的发生[29]。 因此MD2 的作用为oxLDL 诱导炎症反应提供了机制基础。

单核细胞衍生的巨噬细胞是脂质斑块形成的主要细胞。 Xu 等[30]研究表明TLR4 在人类和小鼠富含脂质的AS 病变中优先在巨噬细胞表达。Stoletor 等[31]给予斑马鱼高胆固醇饮食诱导血管脂质积累形成中,研究发现巨噬细胞摄取LDL 需要TLR4 参与。 平滑肌细胞在AS 形成的每一个阶段也起着重要的作用。 Kiyan 等[32]研究发现oxLDL 通过与TLR4 结合诱导平滑肌细胞(smooth muscle cell, SMC)释放粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)与粒-巨噬细胞集落刺激因子 ( granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM-CSF),提示SMC 参与巨噬细胞的主动调节。 Aviram 等[33]研究发现SMC 通过摄取oxLDL,使其表面的TLR4 上调,激活下游NF-κB通路,并释放IL-1β、TNF-α 等炎性细胞因子,促炎的SMC 转化为泡沫细胞,加速脂肪条纹的形成。

2.2 TLR4 在动脉斑块形成中的作用

随着病变的发展,SMC 由静息状态迁移至内膜活化参与动脉斑块的形成,血管内膜发生增厚,SMC是内膜增厚的主要类型细胞[34]。 有研究发现在AS脂质核心区SMC 的TLR4 表达上调,因此TLR4 在动脉粥样斑块形成中起着重要的作用[35]。

Michelsen 等[23]用Apo-E-/-小鼠模型研究表明,TLR4 及其MyD88 的缺失使得主动脉斑块的面积显著减小,降低了AS 的严重程度。 Björkbacka 等[36]用MyD88 缺失小鼠证明,TLR4 缺乏与冠状动脉斑块组成的改变有关,这种改变降低了促炎因子和趋化因子的表达。

2.3 TLR4 在AS 病变后期的作用

在AS 的病变后期,炎性细胞分泌的蛋白酶降解弹性蛋白、纤维蛋白、基质蛋白,斑块不稳定甚至发生破裂。 基质金属蛋白酶 - 9 ( matrix metalloproteinase-9, MMP-9)在动脉粥样斑块不稳定和破裂过程中发挥重要的作用。 oxLDL 通过TLR4/NF-κB 依赖途径促进巨噬细胞释放IL-8、IL-1β、TNF-α,上调MMP-9,加速斑块的破裂[3]。

临床研究表明,急性心肌梗塞(acute myocardial infarction, AMI)患者的破裂和易损斑块的巨噬细胞和淋巴细胞比稳定型心绞痛(stable angina pectoris,SA)患者的细胞高,提示免疫反应的激活与斑块破裂和易损斑块进展有关。 组织学研究表明TLR4 在尸检获得的巨噬细胞浸润的冠状动脉斑块中高表达,表明TLR4 参与动脉斑块的破裂过程[37]。 Yu等[38]通过抽取AMI 患者破裂斑块局部标本,分离单核细胞,患者斑块周围浸润单核细胞的TLR4 高于全身水平。 说明TLR4 在冠状动脉浸润性巨噬细胞中的表达可能是冠状动脉斑块失稳和破裂的重要因素。 Montecucco 等[39]给予ApoE-/-小鼠抗-apoA-1 抗体,研究发现该抗体通过TLR4 途径导致中性粒细胞和MMP-9 含量增加,胶原含量降低,进而增加动脉斑块的易损性,致小鼠的死亡率增加23%。 纤维连接蛋白含有的额外结构域A(FNEDA)作为TLR4 的内源性配体,可激活TLR4 通路。Doddapattar 等[40]对Apo-/-小鼠的研究结果表明,FN-EDA 富集的微环境是通过TLR4 途径诱导的动脉粥样斑块的不稳定。

2.4 NF-κB 在AS 发病过程中的作用

炎症最重要的调节因子之一是转录因子NFκB。 NF-κB 被认为是一种促AS 的因子,它参与了AS 形成过程中的多个病理过程[41]。

人和动物模型的研究均表明了NF-κB 参与了AS 的病变过程。 Methe 等[42]发现急性冠脉综合征和不稳定型心绞痛患者的外周血单核细胞和巨噬细胞的NF-κB 被激活,提示NF-κB 的激活是免疫介导的AS 进展的一种信号机制。 Tang 等[43]用siRNA敲低Apo-E KO 小鼠的TLR4 后,NF-κB 表达随之被抑制,同时血浆中IL-1β、TNF-α 和MCP-1 水平也显著降低。 Wolfrum 等[44]用NF-κB 抑制剂后,降低了Apo-E-/-小鼠主动脉根部动脉粥样硬化病变面积。

在AS 病变的初期,oxLDL 激活内皮细胞发生炎症反应,NF-κB 参与激活内皮细胞粘附分子如e-选择素、血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecules-1, VCAM - 1)、 细 胞 间 粘 附 分 子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1),内皮细胞粘附分子通过与单核细胞的粘附作用,促进了AS 的发生[45]。 Plotkin 等[46]人给Apo-E-/-小鼠应用NF-κB 抑制剂后,减少了泡沫细胞的形成。

炎症介导的VSMC 功能障碍导致动脉内膜增生是AS 发生的关键一步。 血管内皮损伤后,VSMC 由静息状态变为活化的过程中,NF-κB 家族成员p50、p65、p52、c-rel 和RelB 出现上调,抑制蛋白发生下调。 并且在VSMC 激活后,巨噬细胞浸润与VCAM-1、MCP-1 表达平行,血管经过长时间的受损,腔面SMC 继续高表达VCAM-1 和MCP-1,巨噬细胞持续增多,逐渐形成动脉斑块[47]。 在对颈动脉狭窄患者的动脉粥样斑块研究中,NF-κB 过度激活,FasL 表达,NF-κB 参与促凋亡蛋白Fas 配体(Fas ligand,FasL)的转录调控,因此NF-κB/FasL 参与斑块不稳定的机制[48]。

3 TLR4 作为靶点治疗AS

AS 是作为一种其他心血管疾病的主要诱因,预防和治疗AS 成为我们重点关注的问题。 TLR4 因在AS 的发生过程中有重要的作用,因此TLR4 及其下游通路可作为潜在的治疗靶点。 Shen 等[49]研究发现,给予高脂饮食诱导的AS 模型兔子相比于阿托伐他汀治疗组的TLR4/NF-κB 表达明显升高,因此阿托伐他汀可能是通过抑制TLR4/NF-κB 途径治疗AS。 Boekholdt 等[50]对有冠状动脉粥样硬化的病人研究发现TLR4Asp299Gly 多态性与疾病的发生有关。 在使用普伐他汀治疗后,病人动脉内膜中膜厚度变薄, 斑块减小； 并且研究发现携带TLR4Asp299Gly 基因的心血管事件风险低于非携带者,使携带该变异等位基因从普伐他汀的获益更多。 有研究表明,联合使用阿托伐他汀和普罗布考对高脂饮食喂养的Apo-E-/-缺乏的小鼠AS 作用比单独使用阿托伐他汀对AS 的作用强,通过增加抑制NF-κB 调节的TLR4,对AS 的恢复具有一定的意义[51]。

4 讨论

TLR4/NF-κB 是固有免疫的一条重要通路,其介导的炎症反应在AS 的形成、发展等各个阶段发挥重要的作用。 近年来,越来越多的研究通过基因诱导、敲除等方法,证实了TLR4 及其下游信号通路与AS 发病的相关性,并且作为治疗AS 的一个重要靶点。 但目前还存在一些问题需要更深入研究:oxLDL/TLR4 通过上调巨噬细胞表面的CD36 引起巨噬细胞的泡沫化,进而引起细胞因子的释放诱导炎症反应,但是并未有研究证实TLR4 与细胞因子释放的直接作用机制,也未有研究表明TLR4 在巨噬细胞脂质代谢中胆固醇蓄积中的作用；其次TLR4基因多态性与AS 等心血管事件风险的发生关系存在着争议。 有研究表明携带TLR4Asp299Gly 患者给予他汀类药物治疗获益更多, 因此TLR4Asp299Gly 基因多态性对AS 的发生有保护作用,而也有研究发现Asp299Gly 携带者男性患者心肌梗死风险是增加的,而女性无关联。 因此需要更多的临床样本进一步阐明TLR4 基因多态性与AS发生的关系。 因此我们期望在今后的研究中,通过新发现为防治AS 及AS 的发生机制提供新见解。