瑞香素对脊髓损伤大鼠运动功能改善作用的TRL4/NF-κB 信号通路机制研究

吴 军关 涛田 峰刘学起马 剑王庆峰赵芬芬

(宁夏回族自治区人民医院骨科,银川 750021)

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是由外力导致的中枢神经系统疾病,会导致运动功能障碍与慢性疼痛综合征等[1-2]。 近年来WHO 数据表明脊髓损伤呈现高发趋势,全世界每年大约有25000 ～50000 名脊髓损伤患者[3]。 依据脊髓损伤的发病原因、病理变化过程和特征等特点,可将其分为原发性脊髓损伤和继发性脊髓损伤。 研究认为,脊髓损伤诱发的神经功能缺损不仅是由于初始的实质性损伤,而是损伤后的一系列级联分子反应,导致神经元受损。 继发性脊髓损伤是一种机体在细胞和分子水平的主动调控过程,包括一系列的病理性生理变化,如脊髓组织发生的自噬、炎症、氧化损伤、凋亡、坏死和水肿等,都会严重影响神经功能、胶质细胞活化与白质恢复等。 多种因素的联合作用进而诱发永久的病理生理性改变,最终导致肢体运动功能和感觉能力丧失等[4-7]。

TRL4/NF-κB 信号通路广泛参与调控机体多种生理和病理变化过程,与机体免疫调节和炎症反应具有密切关系。 当机体脊髓组织受到损伤后诱发机体炎症反应,诱导TRL4 激活NF-κB 信号通路,介导下游炎症因子的释放和表达。 瑞香素(daphnetin,DAP)是从瑞香科类中草药中提取的香豆素类活性成分。 既往研究表明,瑞香素具有抗氧化、抗癌、抗炎和神经保护等多种药理活性,能够通过抑制机体炎症和氧化应激损伤进而改善机体损伤[8-9]。 因此,本研究采用脊髓损伤大鼠模型,以探究瑞香素对脊髓损伤模型大鼠的氧化应激损伤、炎症水平及TRL4/NF-κB 信号通路的调节作用,并探究其作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

本研究选择75 只SPF 级雄性Wistar 大鼠,8 周龄,均购买自宁夏医科大学实验动物中心[SCXK(宁)2016-0003],动物饲养于宁夏回族自治区人民医院动物实验室[SYXK(宁)2016-0012],体重为(180±20)g,均饲养恒温(25℃)、恒湿(50±5)%条件下,并保持饲养间长期保持通风、干燥和安静的环境,以12 h 的昼夜循环。 本研究经宁夏回族自治区人民医院动物伦理委员会批准(IACUCNY2018AC04)。 本实验的所有动物实验操作均遵循3R 原则,以最大程度保证实验福利。

1.2 主要试剂与仪器

瑞香素购买自上海吉至生化科技有限公司(纯度≥97%,批号:SIG-D5564,上海,中国)；SOD(批号:A001-3-2)、CAT(批号:A007-1-1)、GSH-Px(批号:A005-1-2)、MDA(批号:A003-1-2)均购买自南京建成生物工程研究所(南京,中国)；TNF-α(批号:TNA-H82E3)、IL-1β(批号:IL2-H4256)、IL-6 ( 批 号: CD6-H82E8)、 IL-10 ( 批 号: TRLH5259)均购买自ACRO Biosystems 公司(美国)；Bax(批号:5023S)、Bcl-2(批号:3498S)、Caspase-3(批号:14220S)、Cyt-c(批号:11940S)、BDNF(批号:47808S)、TrkB(批号:4603S)和p-TrkB(批号:4619S)一抗、荧光二抗(批号:5366)均购买自Cell Signaling Technology(US)；BCA 蛋白浓度测定试剂盒(批号:A045-4-2)购买自南京建成生物工程研究所(南京,中国)。

1.3 实验方法

1.3.1 给药及分组和实验大鼠模型的制备

各组实验用大鼠均需在适应一周后开始进行以下试验。 脊髓损伤模型的建立:采用电磁力驱动冲击器(10 g,12.5 mm)进行T10 挫伤性脊髓损伤；而空白组则只接受椎板切除术。 术后各实验鼠在加热垫灯下维持体温在36℃～37℃,直至其完全苏醒[1-2,5]。 术后给予大鼠相应剂量的镇痛(50 mg/kg Temgesic,皮下)和生理盐水(0.5 mL,皮下)以防止疼痛和脱水,然后在饮用水中加入抗生素使其接受抗生素1 周。 创伤后6 h 进行BBB 运动功能评分和CBS 评分测试,并将75 只大鼠随机均分为5 组(n=15):空白组(Sham),模型组(Model),瑞香素低剂量组(30 mg/kg)、中剂量组(60 mg/kg)和高剂量组(90 mg/kg)；术后第4 天开始连续给予瑞香素,连续给药4 周。

1.3.2 运动功能评价

采用BBB 评分法和CBS 评分法以评价各组试验大鼠的脊髓功能的恢复情况。 在造模前1 d、造模后第1、8、15、22 和30 天对各组实验大鼠分别进行BBB 评分和CBS 评分,以评价各组实验大鼠后肢的运动功能状况。 在BBB 评分中分为0～21 分:其中,0 分表示后肢完全无运动能力,21 分为后肢能力完全正常；若BBB 评分在5 分以下则表示脊髓损伤大鼠造模成功。 在CBS 评分中分为0 ～100 分:其中,正常为0 分,全瘫为100 分。

1.3.3 各组实验大鼠脊髓组织中氧化应激相关酶与细胞因子的测定

大鼠分组和处理同上。 各组大鼠连续给药4 周后,经腹腔注射戊巴比妥钠(40～60 mg/kg)麻醉后,处死,快速抽取脊髓组织样本,然后采用冷生理盐水进行冲洗,以后续实验。 在脊髓组织中加入适量的PNS 缓冲液,采用液氮进行研磨、匀浆,在4℃、3500 r/min 条件下离心15 min 后取上清。 所有实验操作均严格按照相应试剂盒说明书进行,检测SOD、CAT、GSH-Px 酶活性及MDA 含量,以及细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 的表达量。

1.3.4 Western blot 检测炎症相关蛋白的表达量

大鼠分组和处理同上。 将实验大鼠麻醉、处死后迅速抽取各组实验大鼠的脊髓组织样本,采用液氮猝灭并在液氮条件下进行研磨成粉末状,再加入适量的RIPA 裂解液使得蛋白组织充分裂解后,在冰浴条件下放置1h,并且在此期间对样本溶液进行适当的震荡、摇匀；然后在4℃条件下,以12000 r/min 离心15 min 后取上清。 然后使用BCA 试剂盒法测定其上清液中的总蛋白浓度。 在10% SDS-PAGE 上分离提取的蛋白,并转移到PVDF 膜上,37℃条件下封闭1h。然后加入相应的一抗在4℃条件下孵育过夜,后将其在TBST 中洗涤3 次。 然后加入二抗,在37℃条件下孵育1h 后进行洗膜。 以β-actin 为内参。 凝胶成像系统成像,Image J 软件计算灰度值。

1.4 统计学方法

本实验中实验数据的统计分析采用SPSS 26.0软件,图表的制作采用GraphPad 5.0 软件,计量数据以平均数±标准差(±s)表示；实验数据中多组间实验数据的比较采用单因素方差分析,以P＜0.05 认为具有显著性统计学差异；BBB 评分和CBS 评分等实验数据的分析则采用方差分析进行比较。

注:A:假手术组；B:模型组:C:脊髓损伤+瑞香素30 mg/kg；D:脊髓损伤+瑞香素60 mg/kg；E:脊髓损伤+瑞香素90 mg/kg；与假手术(Sham)组相比,*P＜0.05,**P＜0.01；与模型(SCI)组相比,#P＜0.05,##P＜0.01。图1 给予治疗后SCI 大鼠在造模前、造模后的BBB 评分图Note. A, Normal group. B, Model group. C, Spinal cord injury +daphnetin 30 mg/kg. D, Spinal cord injury + daphnetin 60 mg/kg. E, Spinal cord injury + daphnetin 90 mg/kg. Compared with sham group, *P＜0.05, **P＜0.01. Compared with SCI group,#P＜0.05,##P＜0.05.Figure 1 BBB score map of SCI rats before and after treatment

2 结果

2.1 SCI 大鼠BBB 评分

BBB 评分结果如图1 所示；造模前各组实验大鼠的BBB 评分无统计学差异,表明各组实验大鼠的运动功能均无障碍。 然而,当实验大鼠开始接受脊髓损伤后,各模型大鼠的运动功能均明显降低,表明造模成功。 假手术组中各实验大鼠的BBB 评分在术前、术后均无显著性差异(P＞0.05),表明手术对实验大鼠的活动并无明显影响。 当给予瑞香素30 d 后,实验大鼠的下肢运动功能得到了明显得到提升,其BBB 评分也得到显著性升高(P＜0.05),呈现剂量-时间依赖性关系。

2.2 Combine behavioral score (CBS)评分

CBS 评分结果如图2 所示；造模前各组实验大鼠的CBS 评分无统计学差异,表明各组实验大鼠的运动功能均无障碍。 然而,当实验大鼠开始接受脊髓损伤后,各模型大鼠的运动功能均明显降低。 当大鼠接受脊髓损伤后1 d,模型组与空白组出现显著性差异(P＜0.05),表明模型建立成功,当模型大鼠各给药组给予相应药物治疗后,各给药组实验大鼠的CBS 评分较模型组实验大鼠的CBS 评分均明显降低(P＜0.05),表明瑞香素对于实验大鼠的脊髓损伤均具有一定的改善作用,且高剂量治疗组效果优于低剂量组的治疗效果。

注:A:假手术组；B:模型组:C:脊髓损伤+瑞香素30 mg/kg；D:脊髓损伤+瑞香素60 mg/kg；E:脊髓损伤+瑞香素90 mg/kg；与假手术(Sham)组相比,*P ＜0.05,**P＜0.01；与模型(SCI)组相比,#P＜0.05,##P＜0.01。图2 给予治疗后SCI 大鼠在造模前、造模后的CBS 评分图Note. A, Normal group. B, Model group. C, Spinal cord injury +daphnetin 30 mg/kg. D, Spinal cord injury + daphnetin 60 mg/kg. E,Spinal cord injury + daphnetin 90 mg/kg. Compared with sham group,*P ＜0.05, **P＜0.01. Compared with SCI group,# P ＜0.05,##P＜0.05.Figure 2 CBS score map of SCI rats before and after treatment

2.3 瑞香素对SCI 大鼠脊髓组织氧化应激状态的影响

机体氧化应激水平严重影响脊髓损伤后恢复。本研究结果显示,与假手术组实验大鼠相比,模型组实验大鼠脊髓组织中SOD(图3A)、GSH-Px(图3B)与CAT(图3C)活性较空白实验大鼠显著性降低(P＜0.05),MDA(图3D)含量显著性升高；然而,当给予实验大鼠相应剂量的瑞香素治疗之后,其脊髓组织中SOD、CAT、GSH-Px 活性和MDA 含量均有显著性回调,表明给予药物治疗后脊髓损伤大鼠的氧化应激状态具有显著的改善作用。 其中,高剂量组的治疗效果优于低剂量组的疗效。

2.4 瑞香素对GM1 对SCI 大鼠脊髓组织中TNFα、IL-1β、IL-6 和IL-10 含量的影响

炎症在脊髓损伤的发生、发展过程中也具有重要作用。 因此,本研究测定了各组实验大鼠脊髓组织中TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-10 炎症因子水平的变化,具体如下图所示。 与假手术组实验大鼠相比,模型组实验大鼠脊髓组织中TNF-α(图4A)、IL-1β(图4B)、 IL-10(图4C)和IL-6(图4D)含量均显著性升高(P＜0.05),表明机体处于过炎症状态。 当给予药物治疗后,机体内细胞因子水平均有所回调(P＜0.05),表明瑞香素对脊髓损伤诱发的机体炎症具有显著性的调节作用。

注:A:假手术组；B:模型组:C:脊髓损伤+瑞香素30 mg/kg；D:脊髓损伤+瑞香素60 mg/kg；E:脊髓损伤+瑞香素90 mg/kg；与假手术(Sham)组相比,*P＜0.05,**P＜0.01。 与模型(SCI)组相比,#P＜0.05,##P＜0.01。图3 瑞香素对SCI 大鼠脊髓中SOD(A)、GSH-Px(B)、CAT(C)活性和MDA(D)含量的影响Note. A, Normal group. B, Model group. C, Spinal cord injury + daphnetin 30 mg/kg. D, Spinal cord injury + daphnetin 60 mg/kg. E, Spinal cord injury + daphnetin 90 mg/kg. Compared with sham group, *P＜0.05, **P＜0.01. Compared with SCI group,#P＜0.05, ##P＜0.05.Figure 3 Effect of daphnetin on the activity of SOD (A), GSH-Px (B), CAT (C) and MDA (D) in spinal cord of rats were affected by treatment

2.5 瑞香素对SCI 大鼠脊髓组织中凋亡信号通路的影响

如图5 所示,与假手术组相比较,模型组的Bax/Bcl-2(图5A、5B)、Caspase-3(图5C、5D)和Cytc(图5E、5F)含量均显著性升高,表明脊髓损伤导致了大鼠脊髓组织促凋亡相关蛋白显著性增加；当给予瑞香素后,其Bax/Bcl-2(图5A、5B)、Caspase-3(图5C、5D)和Cyt-c(图5E、5F)含量的变化均发生显著性回调,表明瑞香素对脊髓损伤诱发的凋亡相关蛋白异常表达具有显著的调节作用,且高剂量组治疗效果优于低剂量组。

2.6 瑞香素对SCI 大鼠脊髓组织中BDNF/TrkB和TRL4/NF-κB 信号通路的影响

如图6 所示,与假手术组相比较,模型组的BDNF(图6A、6B)、TrkB(图6C、6D)、p-TrkB(图6E、6F)、TRL4(G/H)和NF-κB p65(I/K)含量均显著性升高,表明脊髓损伤导致了大鼠脊髓组织BDNF/TrkB 信号通路和TRL4/NF-κB 信号通路相关蛋白异常表达；当给予瑞香素后,其BDNF(图6 A、6B)、TrkB(图6C、6D)、p-TrkB(图6E、6F)、TRL4(G/H)和NF-κB p65(I/K)含量的变化均发生显著性回调,且呈现剂量依赖性,表明瑞香素能够显著性调节BDNF/TrkB 信号通路和TRL4/NF-κB 信号通路。

3 讨论

脊髓损伤是由脊柱损伤后诱发的严重并发症之一,包括原发性脊髓损伤与继发性脊髓损伤。 其中继发性脊髓损伤是损伤后机体细胞和分子水平的一种主动调节过程,具有可逆性和可控性；这也是目前脊髓损伤治疗的主要阶段[10-11]。 目前,药物治疗是降低脊髓损害程度最为快捷和有效的方法之一。 然而,目前临床治疗中,尚无一种安全有效的药物。 因此,寻找一种安全、有效、多靶点的抗脊髓损伤药物,已成为脊髓损伤相关疾病及其药物研发的新热点和难点。

注:A:假手术组；B:模型组:C:脊髓损伤+瑞香素30 mg/kg；D:脊髓损伤+瑞香素60 mg/kg；E:脊髓损伤+瑞香素90 mg/kg；与假手术(Sham)组相比,*P＜0.05,**P＜0.01。 与模型(SCI)组相比,#P＜0.05,##P＜0.01。图4 瑞香素对SCI 大鼠脊髓中TNF-α(A)、IL-1β(B)、IL-10(C)和IL-6(D)含量的影响Note. A, Normal group. B, Model group. C, Spinal cord injury + daphnetin 30 mg/kg. D, Spinal cord injury + daphnetin 60 mg/kg. E, Spinal cord injury + daphnetin 90 mg/kg. Compared with sham group, *P＜0.05, **P＜0.01. Compared with SCI group,#P＜0.05, ##P＜0.05.Figure 4 Effect of daphnetin on the contents of TNF-α (A), IL-1β (B), IL-10 (C) and IL-6 (D) in spinal cord of SCI rats

注:A:假手术组；B:模型组:C:脊髓损伤+瑞香素30 mg/kg；D:脊髓损伤+瑞香素60 mg/kg；E:脊髓损伤+瑞香素90 mg/kg；与假手术(Sham)组相比,*P＜0.05,**P＜0.01。 与模型(SCI)组相比,#P＜0.05,##P＜0.01。图5 瑞香素对实验大鼠脊髓组织中Bax/Bcl-2(A/B)、Caspase-3(C/D)和Cyt-c(E/F)水平的影响Note. A, Normal group. B, Model group. C,Spinal cord injury + daphnetin 30 mg/kg. D,Spinal cord injury + daphnetin 60 mg / kg. E,Spinal cord injury + daphnetin 90 mg/kg. Compared with sham group, *P＜0.05, **P＜0.01. Compared with SCI group,#P＜0.05, ##P＜0.05.Figure 5 Effect of daphnetin on Bax/Bcl-2 (A/B), Caspase-3 (C/D) and Cyt-C (E/F)levels in spinal cord tissue of experimental rats

大量研究表明,脊髓损伤过程中伴随着氧化应激损伤[12-13]。 抗氧化剂能够有效降低损伤脊髓组织中乳酸脱氢酶活性,减少超氧阴离子对机体的损害和继发性水肿,继而达到治疗SCI 的目的。 瑞香素是一种天然抗氧化剂,能够激活并促进机体内抗氧化酶活性,对自由基有着高效的清除作用[14-16]。 此外,脊髓损伤过程中伴随着炎症反应的发生。 TNF-α 是炎症早期机体释放的促炎因子,其表达水平的变化与机体的损伤程度密切相关。 IL-1β 参与机体脊髓损伤的过程可能与其能够损伤血脑屏障的完整性密切相关。脊髓损伤诱发大量炎症因子产生,最终导致机体组织处于过度炎症反应和损伤状态[17-19]。 本研究结果显示,瑞香素能够抑制IL-1β 分泌,减少由IL-1β 刺激成骨细胞所产生的NO、PGE2 含量,进而抑制TNF-α 含量,进而发挥抗炎作用。

注:A:假手术组；B:模型组:C:脊髓损伤+瑞香素30 mg/kg；D:脊髓损伤+瑞香素60 mg/kg；E:脊髓损伤+瑞香素90 mg/kg；与假手术(Sham)组相比,*P＜0.05,**P＜0.01。 与模型(SCI)组相比,#P＜0.05,##P＜0.01。图6 瑞香素对实验大鼠脊髓组织中BDNF(A/B)、TrkB(C/D)、p-TrkB(E/F)、TRL4(G/H)和NF-κB p65(I/K)水平的影响Note. A, Normal group. B, Model group. C, Spinal cord injury + daphnetin 30 mg/kg. D, Spinal cord injury + daphnetin 60 mg/kg. E, Spinal cord injury + daphnetin 90 mg/kg. Compared with sham group, *P＜0.05, **P＜0.01. Compared with SCI group,#P＜0.05, ##P＜0.05.Figure 6 Effect of daphnetin on the levels of BDNF (A/B), TrkB (C/D), p- TrkB (E/F),TRL4 (G/H) and NF-κB p65 (I/K) in spinal cord tissue of experimental rats

神经元细胞凋亡程序的启动对继发性脊髓损伤有直接的促进作用,Bax 蛋白具有促进细胞凋亡,并拮抗Bcl-2 的抑制凋亡作用,并能够激活Caspase蛋白酶家族,最终加速细胞凋亡。 Caspase-3 是评价细胞凋亡的重要指标之一,可介导多种细胞凋亡途径。 此外,TNF-α 又可激活凋亡相关蛋白Caspase-3的活化,进而促进机体细胞凋亡[20-23]。 为了进一步探究瑞香素对脊髓损伤诱发的凋亡作用的改善作用,本实验检测了瑞香素对脊髓组织的凋亡蛋白表达的改善作用,结果显示,瑞香素能够降低脊髓组织中Bax、Caspase-3、Cyt-c 凋亡蛋白的表达,进而减少或抑制脊髓神经元细胞凋亡,修复中枢神经系统,并发挥神经保护作用。

研究表明,脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)可诱导和促进多种神经元的存活和分化,并能够改善受损神经元的修复作用。 然而,当机体脊髓组织发生损伤后,可诱导BDNF 活化,并促进其与高亲和力酪氨酸蛋白激酶受体B(tyrosine kinase B,TrkB)相互作用并发生结合,促进机体受损神经细胞的生存和发育,进而发挥神经保护作用,有效促进机体脊髓组织损伤后的轴突修复和肢体运动功能的恢复等作用[24],在调节神经节生长和神经再生过程中起着至关重要的作用。 TLR4 信号转导通路是目前发现的重要的炎性通路之一,TLR4 高表达时,激活NF-κB,进而启动细胞因子TNF-α、IL-6 激活TLR4,最终引起级联反应[25-26]。 此外,NF-κB 的活化还可进一步激活Caspase-3 信号通路介导细胞凋亡。 细胞异常凋亡在继发性脊髓损伤过程中起着重要作用。 本研究发现,瑞香素能够调节模型大鼠凋亡相关蛋白的异常表达,这一作用可能与其能够抑制TRL4/ NF-κB信号通路的活化有关。 因此,TLR4/NF-κB 信号通路同脊髓损伤后的恢复具有密切关系。

综述所述,瑞香素能够改善SCI 大鼠的运动功能,减轻SCI 大鼠的氧化应激损伤和炎症水平,并能够抑制脊髓组织的凋亡,进而改善脊髓损伤,其作用机制可能是通过调节TLR4/NF-κB 信号通路来发挥作用的。