雷 超 刘 聪 李晓媚 李 晨 刘志华 刘 亭
肠屏障功能损伤与多种慢性疾病如2型糖尿病、高血压的发展有关,因其屏障功能受损时,肠道内共生菌产生的脂多糖、肽聚糖和其他毒素甚至细菌都可以穿过肠道进入外周血液循环产生慢性炎症[1-2],从而危害人体健康,因此维护肠屏障的正常功能对人类健康显得至关重要。在肠道内,肠屏障、肠道菌群和免疫系统三者之间维持着相对平衡,细胞自噬通过参与机体抵御肠道菌群侵袭、保持肠屏障完整性从而调节肠屏障功能的稳态,细胞自噬是细胞质的降解方式之一,通过这种方式细胞内的受损物质被运送到溶酶体降解,之后为细胞提供能量或合成大分子前体物质[4],当细胞自噬功能紊乱时,肠上皮细胞受损并影响屏障功能[5],探究细胞自噬功能失调机制和影响的因素是阐明肠屏障稳态机制的迫切需要。
中国大部分人的每日盐摄入量都大于其生理需要量,过量的盐摄入量对人体健康的危害越来越被人们所重视[6],近期的研究显示高盐饮食损伤肠上皮物理屏障[7],然而高盐饮食对肠屏障功能损伤的影响还未得到充分研究,其具体机制仍不清楚。此外有研究发现高盐状态可诱导低氧诱导因子1(HIF1A)介导的细胞自噬,同时细胞内Na+浓度升高可触发活性氧(ROS)依赖性的细胞自噬上调,关于高盐饮食是否通过调节细胞自噬影响肠屏障的功能未见报道,本研究通过细胞和动物实验探索高盐饮食是否与肠屏障损伤有关,并探索细胞自噬是否参与调控肠屏障稳态,为肠屏障功能受损的防治提供新的理论和实验依据。
SPF级5周大的雄性C57BL/6小鼠购买于广东省医学实验动物中心,实验之前先适应性喂养7天,小鼠均喂养相同的饮用水和维持饲料或高盐维持饲料,室温维持在(22±2)℃,保持每天12个小时的光照,喂养12周后腹腔注射戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉处死取结肠组织于-80 ℃冻存,取一小部分肠组织用于HE染色。实验通过了广州医科大学附属第五医院实验动物伦理委员会的动物伦理审查。
喂养老鼠的普通维持饲料和高盐饲料均购买于广东省医学实验动物中心,普通饲料和高盐饲料的NaCl含量分别为0.2%,8%,氯化钠(NaCl)购买于广州化学试剂厂,western blotting 鼠抗,兔抗,小鼠抗 β-actin 抗体,鼠抗ZO-1抗体,鼠抗Atg5抗体,兔抗LC3II/I抗体均购自abcam公司,FITC标记葡聚糖购买于上海西宝生物科技有限公司。
1.3.1 FITC-dextran实验 小鼠喂养12周后,隔夜禁食不禁水,第二日清晨将FITC-dextran溶于水,并以100 mg/kg的量给小鼠灌胃,4小时后经小鼠腹主动脉取800 μL全血,以200 g转速离心5 min,取上层无色血浆100 μL用于荧光强度测定。
1.3.2 HE染色观察肠组织形态学变化 取一部分肠组织用冷生理盐水冲洗后,置于4%多聚甲醛中固定,24 h后将其修剪后置于包埋盒中脱水过夜; 次日进行浸蜡、包埋,冷凝后进行组织切片、烤片; 将切片进行脱蜡水化并染色,流水冲洗,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片; 在光学显微镜下观察肠组织形态学变化。
1.3.3 Western blotting 使用 RIPA 提取肠组织裂解物,使用SDS-PAGE分离胶电泳分离蛋白质并转至 PVDF 膜,使用 5%胎牛血清 4℃封闭膜过夜。分别孵育 ZO-1、Occludin、Atg5 及 LC3II/I一抗(浓度 1 ∶1000)及二抗(1 ∶5 000),最后用 ECL 底物试剂盒检测,重复 3次实验。
1.3.4 细胞培养和氯化钠处理 使用含有 10% 胎牛血清的 DMEM 培养液培养肠癌细胞株Coco2,置于 37 ℃,5% CO2 培养箱中孵育。取处于对数生长期的细胞株至添加了0,50,80,100 mmol/L浓度NaCl的培养基,待细胞生长密度约为 70%时收集细胞用于后续实验。
1.3.5 细胞转染 取处于对数生长期的肠癌细胞株coco2,待细胞生长密度约为 70%时进行转染,继续在培养箱内常规培养 48 h 后,收集细胞用于后续实验。
高盐饮食对小鼠肠屏障通透性的影响见图1,FITC通透性结果显示,与正常饮食组小鼠相比,高盐饮食组小鼠血浆FITC-dextran浓度明显升高(P<0.05)。
图1 NSD组和HSD组小鼠FITC-dextran法测定肠通透性结果,NSD(正常饮食组),HSD(高盐饮食组)
图2 NSD组和HSD组小鼠结肠组织的HE染色观察,NSD(正常饮食组),HSD(高盐饮食组)
高盐饮食对结肠组织形态学的影响见图3,HE 染色可见正常饮食组小鼠结肠上皮绒毛光滑平整,杯状细胞较多,高盐饮食组小鼠结肠上皮绒毛缺损不平整,杯状细胞减少。
高盐饮食对结肠紧密连接蛋白的影响见图3,Western blot结果显示,与正常饮食组小鼠相比,高盐饮食组小鼠ZO-1、Occludin表达明显降低(P<0.05)。
高盐饮食对结肠自噬相关蛋白的影响见图4,Western blot结果显示,与正常饮食组小鼠相比,高盐饮食组小鼠ATG5、LC3II/I 表达明显降低(P<0.05)。
添加到培养基中的NaCl浓度梯度分别是0、50、80、100mmol/L,NaCl对Coco2细胞肠屏障和自噬蛋白表达的影响见图5,Western blot结果显示,随着NaCl浓度的递增,ATG5、LC3II/I比值呈现出逐渐递减的趋势,此与动物实验的结果一致。
细胞自噬对肠紧密连接的影响见图6,Western bolt结果显示,coco2细胞株敲低ATG5表达后,紧密连接蛋白ZO-1、Occludin表达均明显下降(P<0.05)。
结肠作为肠道内菌群定植的主要部位,结肠上皮面临着体内共生菌和饮食中多种物质的刺激,因此健康的饮食习惯对维持结肠屏障稳态至关重要,而不健康的饮食习惯如高盐饮食、高脂饮食已经被发现可通过影响肠道内环境稳态进一步对机体产生不利的影响,近年来研究发现高盐饮食诱导小鼠肠Th17/Treg失衡,表现为增加肠道固有层Th17细胞的反应性、降低Treg细胞的免疫抑制功能,从而使结肠上皮层促炎性介质聚集损伤肠上皮屏障[8],之后Jingjuan Hu等观察到高盐饮食影响了结肠上皮物理屏障,如ZO-1、Occludin蛋白表达下降,Claudin-2蛋白表达增加[7]。参照前期高盐饮食有害作用的研究文献[9-10],其中实验组大多选用氯化钠浓度为8%的饲料,因此本研究采用含浓度为8%的氯化钠的高盐饮食饲料喂养小鼠,同时并未在小鼠饮用水中添加氯化钠,以期更好地模拟中国人的高盐饮食习惯,结果不仅显示紧密连接蛋白ZO-1、Occludin表达下降,而且结肠组织HE染色发现高盐饮食导致结肠上皮形态学变化,如绒毛缺损,杯状细胞减少,然而前期的其它研究并未发现这一表型,可能原因是本研究高盐饮食喂养时间长达4个月,明显长于前期研究,2个月或3个月时结肠组织形态学还未发生明显变化。另外本研究发现高盐饮食增加了肠屏障通透性,这暗示高盐饮食损伤肠屏障不仅影响到肠内组织,增加的通透性可能为肠道菌群和其产生的代谢物进入外周血液循环影响机体其它系统提供了机会。
图3 NSD组和HSD组小鼠结肠组织ZO-1、Occludin的蛋白水平变化,NSD(正常饮食组),HSD(高盐饮食组)
图4 NSD组和HSD组小鼠结肠组织LC3II/I、ATG5的蛋白水平变化,NSD(正常饮食组),HSD(高盐饮食组)
图5 Western blot检测Coco2细胞在不同浓度NaCl处理下自噬相关蛋白LC3II/I、ATG5表达的变化,NSD(正常饮食组),HSD(高盐饮食组)
图6 敲低ATG5表达后Western blot检测Coco2细胞紧密连接蛋白ZO-1、Occludin表达的变化,NSD(正常饮食组),HSD(高盐饮食组)
细胞自噬与细胞凋亡、细胞衰老一样,是十分重要的生物学现象[11],细胞自噬是高度保守的通过溶酶体介导对受损的蛋白质和细胞器分解和循环利用的过程[12],细胞自噬被过度上调或下调都会产生不利的影响。研究报道高盐饮食或影响细胞自噬,长期高盐摄入加速诱导的高血压性左心室功能恶化与细胞自噬水平过度上调有关,其具体机制可能由于心肌间质高渗诱导细胞内Na+浓度升高触发活性氧(ROS)依赖性的自噬上调[13-14]。Tomohiro Osanai等报道高盐饮食通过抑制ATG7表达下调小鼠心脏、肝脏、肾脏组织的细胞自噬水平[16],高盐饮食与细胞自噬的关系在肠组织还未得到研究,本研究在细胞和动物水平上发现高盐降低了LC3II/LC3I比值,因为LC3II蛋白与自噬体数量相关,微管相关蛋白轻链3 (LC3)目前被广泛用于监测细胞自噬,其中方法之一是检测LC3转换率(LC3II/LC3I),因此本研究结果暗示高盐饮食降低了结肠组织的细胞自噬水平,这一过程或许是通过下调ATG5的表达,自噬体的形成需要30种自噬相关蛋白(ATGs)的参与,其中ATG5和ATG7是诱导自噬体形成的重要调控蛋白[17],ATG5可与清道夫蛋白RACK1结合启动自噬体形成[18],也可与ATG12、ATG16结合形成复合物,有助于自噬体膜的延伸和成熟[19]。
肠上皮细胞对外源物质的耐受和防御平衡是维持稳态的重要基础,同时与机体其它组织细胞不同的是,肠上皮细胞经历着周期较快的更新和再生,这一过程与细胞自噬密不可分,细胞自噬通过调节肠上皮细胞的功能对维持这一稳态起着重要作用[19],Prashant等首先报道细胞自噬通过靶向降解紧密连接蛋白Claudin-2降低细胞旁小的溶质和离子通道从而减少肠屏障通透性[20],随后张琮等在结肠炎动物模型上发现自噬降解过程受抑制是导致紧密连接蛋白claudin-2上调和肠屏障损伤的重要原因[21],此外claudin-1和ZO-1的表达也被发现受到自噬调节[22]。与前期的研究一致,本研究发现在Coco2细胞敲低ATG5表达抑制细胞自噬后,紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达下调,由此可见,ATG5通路有关的细胞自噬与肠屏障功能具有密切的调控关系。综上所述,本研究发现长期高盐饮食损伤了肠上皮屏障,这一表型与ATG5介导的细胞自噬受抑制密切相关,然而关于细胞自噬调节紧密连接蛋白的方式尚不清楚,具体机制还需要进一步深入研究。