m6A动态调控网络在生殖系统中的作用

张萌卉，刘笑聪，郭艺红

N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）是在真核生物中普遍存在的一种RNA表观遗传修饰，见于哺乳动物、植物、酵母、果蝇等各种真核生物及病毒RNA中。自m6A全转录组分析技术及去甲基化酶肥胖相关蛋白（FTO）的发现，m6A功能逐渐成为研究热点。越来越多的研究表明，m6A参与多种生物过程，如肿瘤发生、干细胞转化和配子生成等[1]。现对m6A检测技术的发展、动态网络的形成以及m6A在男女生殖系统的研究进展进行综述。

1 m6A概述

1.1 m6A检测技术的发展RNA m6A修饰是1974年在纯化的带有多聚腺苷酸尾巴的RNA中首次被发现的[2]，但传统检测方法（如液相色谱-串联质谱法、斑点印迹法等）无法定位RNA中的m6A，使m6A研究进展缓慢。直到2012年m6A免疫共沉淀技术与高通量测序技术（MeRIP-seq）相结合的技术出现，首次揭示了m6A在mRNA中的广泛分布及富集位置，m6A生物学功能研究得以迅速发展。2020年，刘建钊团队和贾桂芳团队分别开发出新的m6A高通量测序方法：一种是m6A-label-seq，利用细胞代谢进行单碱基分辨测序[3]；另一种是m6A-SEAL（FTO-assisted m6A selectivechemical labeling method），一种无抗体、FTO辅助化学标记方法[4]，进一步提高检测方法的准确度和敏感度。

近年，有学者将人工智能技术与miCLIP-Seq数据相结合，开发出基于深度学习框架的DeepM6ASeq模型，不仅可以用于预测和描述含m6A的序列，还可以借助深度学习模型中的显著性地图使m6A位点的位置可视化，为未来m6A的研究提供更多的可能[5]。

1.2 m6A动态网络的作用多项研究表明，m6A在3种酶的动态调控下发挥各种生物功能：①甲基转移酶，包括METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429和RBM15/15B等；②去甲基化酶，包括FTO和ALKBH5，两者均为α-KG和Fe（Ⅱ）依赖的AlkB双加氧酶家族成员；③结合蛋白，包括YTH蛋白家族、HNRNP蛋白家族等，识别并介导m6A发挥调控作用。

m6A动态网络能够在相关酶的催化调控下介导RNA剪接、出核、翻译等多种RNA代谢过程。①影响RNA剪接：METTL3、METTL14、FTO、ALKBH5和YTHDC1定位在富含剪接因子的核斑点，强烈提示m6A与RNA剪接事件的关系。YTHDC1与核不均核糖核蛋白（hnRNP）及其他调节因子相互作用参与RNA剪接过程[6]。②影响RNA出核：人类细胞系中，YTHDC1通过与富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子3（SRSF3）相互作用促进核内m6A修饰RNA重新分配至细胞质中[7]。③调节RNA翻译：YTHDF1与翻译起始因子eIFs、核糖体等翻译机制相互作用，促进翻译起始，确保m6A修饰的动态转录本有效生成蛋白质[8]。④调节RNA稳定性：RNA稳定性可直接影响细胞内总体RNA丰度，m6A通过多种蛋白的调节参与该过程，即m6A选择性结合YTHDF2蛋白，使胞质中mRNA定位从翻译池向衰变点转移，从而降低mRNA稳定性，加速转录本衰变[9]。

2 m6A在女性生殖系统中的研究进展

2.1 m6A在卵母细胞成熟中的作用卵母细胞的成熟是指在排卵前数小时，充分发育的优势卵泡中的卵母细胞恢复减数分裂，从第一次减数分裂前期的双线期继续发育至第二次减数分裂中期的过程。因此，卵母细胞第一次减数分裂阻滞与恢复的精密调控是卵母细胞成熟的关键，对卵子质量、受精过程及早期胚胎发育具有十分重要的作用。猪卵母细胞从胚泡期到第二次减数分裂的发育过程中，总m6A水平显著升高。体外成熟过程中，甲基化抑制剂能使核酸m6A水平降低，并使胚泡破裂率、第一极体排出率、孤雌生殖的卵裂率和囊胚率显著降低，严重阻碍卵母细胞成熟[10]。上述研究提示m6A在卵母细胞成熟过程中发挥重要作用。

近期，多项研究对m6A参与调控卵母细胞成熟的机制进行探索。甲基化抑制剂干扰成熟促进因子（MPF）调控的染色体/纺锤体组装，导致减数分裂过程中纺锤体缺陷和染色体错位概率增加，进而影响猪卵母细胞成熟[10]。甲基化酶METTL3可能通过调控mRNA翻译效率，影响纺锤体形态和第一极体排出率，进而影响卵母细胞成熟[11]。Ythdc1基因的缺失导致小鼠卵母细胞大量的可变剪切缺陷，改变3′非翻译区（3′-UTR）长度，造成卵母细胞发育停滞，无成熟卵泡，无法产生后代[12]。有研究发现KIAA1429可能参与YTHDC1的可变剪切。YTHDC1通过识别Kiaa1429编码的前体RNA上的m6A修饰，招募剪接因子促进可变剪切。因而Kiaa1429基因缺失会引起卵泡相关基因可变剪切异常，转录组谱表达改变，影响颗粒细胞分化，卵泡发育缺陷，胚泡未发生破裂，丧失继续减数分裂的能力[13]。

甲基化结合蛋白Ythdf2参与母体转录本的降解，敲除母系遗传Ythdf2，在斑马鱼早期胚胎发育中母体mRNA衰变受阻，合子基因组激活受阻，使受精后早期胚胎发育迟缓[14]，在小鼠实验中也观察到胚胎发育停滞，出现异常的胞质分裂[15]。

2.2 颗粒细胞中m6A调控对卵泡发育的作用卵泡发育是个漫长而复杂的过程，受到多种信号分子、激素的精密调控。颗粒细胞是卵泡的重要组成部分，在发育过程中受到卵泡内各种细胞因子的调控，同时也通过细胞连接等方式影响卵泡的发育。颗粒细胞的增殖、分化和凋亡与卵泡选择、卵泡闭锁等各种发育过程密切相关，参与卵巢功能减退和多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）等疾病的发生发展。

m6A是真核生物中普遍存在的RNA修饰，近年来多项研究发现，m6A在卵巢颗粒细胞中含量丰富，在颗粒细胞对卵泡发育调控中发挥重要作用。颗粒细胞中m6A水平异常影响颗粒细胞的凋亡和增殖，损害卵巢功能，并进一步导致早发性卵巢功能不全（prematureovarian insufficiency，POI）[16]。长期接受免疫抑制剂治疗的年轻女性肿瘤患者，常见的不良反应是卵巢功能减退，严重影响生育能力。免疫抑制剂环磷酰胺以时间和浓度依赖的方式影响m6A含量，且增加甲基化酶，抑制去甲基化酶FTO，抑制卵巢功能[17]。FOXO3是参与颗粒细胞增殖与凋亡的重要因子，其在颗粒细胞中的过表达与PCOS患者中颗粒细胞的高凋亡相关。与正常排卵女性相比，非肥胖PCOS患者黄素化颗粒细胞中m6A修饰的改变影响FOXO3转录[18]。

2.3 m6A在性激素合成中的作用以斑马鱼为研究对象的实验表明，Mettl3突变导致的卵母细胞成熟障碍部分与性激素合成有关。在雌性斑马鱼中，黄体生成激素（LH）信号负责刺激卵母细胞成熟和排卵，11-酮基睾酮（11-KT）和雌二醇（E2）是斑马鱼主要的雄激素和雌激素。Mettl3基因突变的斑马鱼卵母细胞大多数发育阻滞，伴有低水平LHβ，低血清浓度的11-KT和E2，加用双羟孕酮处理，可补救卵母细胞成熟缺陷[19]。m6A修饰水平降低，导致对上述激素合成有重要作用的基因表达中断。m6A对性激素合成的调控作用成为研究m6A动态调控网络对卵母细胞成熟调控机制的另一种切入口。

3 m6A在男性生殖系统中的研究进展

精子生成包括精原细胞的增殖分化、精母细胞的减数分裂和圆形精子细胞减数分裂后的精子发生，是一种高度特异性的分化过程，离不开转录、转录后及翻译水平的精准调控。

3.1 m6A与男性生殖功能的关系精液质量下降和精子功能损害是影响男性生殖功能的常见原因，主要疾病包括弱精子症和少精子症。Yang等[20]对20例弱精子症患者和健康男性的精液进行分析，发现弱精子症患者精子mRNA中m6A明显升高，升高的m6A与精子活力下降显著相关。睾酮等生殖激素与精液质量密切相关[21]，m6A甲基化可能通过影响Camkk2转录本的稳定性和提高Ppm1a的翻译效率调节自噬，降低睾酮合成，继而损害生殖功能[22]。以上研究表明，m6A甲基化修饰在男性生殖功能中发挥重要的调控作用。因此，充分了解m6A在生殖功能中的分子机制，有利于为弱精子症和少精子症患者提供更有效的治疗。

3.2 m6A影响男性生殖功能的机制METTL3介导的m6A修饰影响转录本的选择性剪切事件，导致突变组小鼠睾丸中多种基因外显子增加（exon inclusion）水平降低，产生较短的转录本，从而影响精原细胞分化、生殖细胞数量减少[23]。METTL3和METTL14依赖的m6A修饰调节甲基化转录本的翻译，促进精子发生所必需蛋白质的翻译，同时在精子发生晚期抑制翻译，以防止过量的蛋白质产生有害后果[24]。两者单一缺失会促进部分基因的翻译，包括DNA复制和修复相关的因子，其中Gfer基因过表达与男性不育有关；两者联合缺失会抑制翻译过程，同时可在突变体中观察到人类少弱畸形精子综合征（oligo-astenoteratozoospermia syndrome，OAT）表型[25]。

去甲基化酶ALKBH5在睾丸中含量丰富，在睾丸发育和精子发生中发挥重要作用。Zheng等[26]发现，去甲基化酶ALKBH5缺失的纯合子小鼠睾丸体积小，精子活力下降，数量和形态异常。转录组分析显示差异表达的基因与精子发生相关，涉及凋亡和异常分化等过程[26]。这表明哺乳动物mRNA中可逆的m6A修饰在基本的生物过程中起着广泛和关键的作用。随后有研究对ALKBH5影响精子发生的潜在机制进行研究，发现ALKBH5介导的m6A擦除对RNA的正确剪接和长3′-UTR mRNA的产生至关重要。Alkbh5缺失导致参与精子发生和精子鞭毛形成的重要基因，如Foxj1、Dnaaf3、Crem、Prm2，发生异常剪切，产生更多的短3′-UTR转录本，并在伸长型精子细胞中快速降解，从而降低雄性鼠的生育力[27]。

3.3 m6A在精原细胞增殖中的作用m6A去甲基化酶FTO在精原细胞增殖中发挥重要作用。甲氯芬酸酯在体外通过与FTO竞争性结合核酸，抑制FTO的去甲基酶活性，有效提升3′-UTR m6A修饰，降低Cdk2的mRNA稳定性，从而显著抑制精原细胞增殖；同时，3′-UTR上m6A位点的突变可以减轻Cdk mRNA的降解[28]。

3.4 m6A在生殖干细胞中的作用有丝分裂向减数分裂的转变是生殖干细胞开始分化的关键事件。Bailey等[29]发现，在减数分裂的早期阶段，YTHDC2通过转录后修饰下调先前的有丝分裂程序（如细胞周期蛋白CyclinA2的表达），并促进减数分裂和分化基因（Dmc1、Spo11、Sycp3）的适当表达。Jain等[30]有同样的发现，Ythdc2突变型精原细胞的有丝分裂发生相对正常，但是在减数分裂中过早地出现凝聚染色体和单极纺锤体，并发生凋亡；同时该研究发现Ythdc2和Meioc突变表型在这方面高度一致，提示Ythdc2和Meioc在减数分裂开始前后共同调节生殖细胞的发育。

4 结语与展望

m6A动态调控网络存在于卵母细胞减数分裂、精子发生等生殖过程中。在女性生殖系统中，m6A通过多种途径调控卵母细胞成熟，如干扰染色体/纺锤体组装、影响转录本剪切、翻译及降解。颗粒细胞中m6A水平异常促进颗粒细胞的凋亡，进而损害卵巢功能，与POI、PCOS等生殖内分泌疾病的发生发展密切相关。在男性生殖系统中，多种酶类介导的m6A修饰通过转录后修饰影响转录本的剪切、翻译等过程，导致精原细胞分化异常，生殖细胞质量和数量减少，严重影响生育力。但是m6A动态调控网络在生殖系统中的具体作用机制还需更深入的研究，为未来生殖障碍性疾病的诊治提供更有效的帮助。