胚胎早期发育过程中主要信号通路的作用机制

陈然然，宋殿荣

辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）已在临床广泛开展，但与ART相关的低成功率和高畸形率一直是困扰临床的难题。针对该现象目前主要从引进新兴技术和优化操作方法等方面着手，但往往收效有限。人类胚胎发育是一个极其复杂的生命过程，对该过程认识的局限性导致针对胚胎发育分子水平的调控与治疗发展缓慢。由于不同物种间胚胎早期发育的分子机制具有高度的保守性，因此，通过小鼠、斑马鱼等模型动物可以在一定程度上了解人类胚胎早期发育的分子变化。现综述不同信号通路在胚胎早期发育过程中的作用，旨在为ART中提高胚胎种植率和改善妊娠结局的分子干预相关研究提供理论参考和研究思路。

1 Hippo信号通路

在小鼠胚胎发育过程中，第一次细胞谱系分离发生在桑葚胚和囊胚阶段之间，即胚胎植入前。8细胞晚期，随着致密化的开始各个卵裂球出现最初的极性变化，至桑葚胚期（16～32细胞期），外部细胞均获得了顶端－基底极性，并分化为一种囊状上皮组织，即滋养外胚层（trophectoderm，TE）。TE细胞在植入过程中必不可少，将来参与形成绒毛膜，进一步发育成胎盘。内部细胞是非极性细胞，集中于囊胚的一侧形成内细胞群（inner cell mass，ICM），ICM将发育成为胚胎体和一些胚外组织[1]。Hippo信号通路在ICM中激活，在TE中失活，这种位置依赖性的激活与失活促进了不同细胞的发育命运，在第一次谱系分离中起核心作用[2]。

在哺乳动物中，Hippo信号通路的核心成分有MST1/2、SAV1、LATS1/2和MOB1，YAP为该通路下游的主要效应分子。当Hippo信号通路被抑制时，YAP可被转运至细胞核内与转录因子如TEAD4结合，促进Cdx2、Gata3等TE特异性基因的转录，从而使细胞分化为TE谱系。相反，当Hippo通路激活时，由于YAP在细胞质中被降解，细胞核中无法形成TEAD-YAP复合物，从而导致Sox2、Oct4基因转录增加，促进ICM谱系的形成。

Sasaki等[3]研究发现，由E钙黏蛋白（E-cadherin）介导的细胞间黏附和Par-aPKC（partition-defectiveatypical protein kinase）系统介导的细胞极化是导致Hippo信号通路在ICM和TE中差异性激活的根本原因，缺乏TEAD4的胚胎无法表达Cdx2基因，从而不能发育产生TE[4]。当然，过度表达LATS2激酶（Hippo的激活剂）会使外部细胞中Cdx2的转录降低，而抑制LATS1和LATS2的活性，导致Cdx2基因在内部细胞中的异常表达[5]。可见Hippo信号通路相关分子的正常表达是胚胎进一步发育的前提。

2 成纤维细胞生长因子/细胞外信号调节激酶（fibroblast growth factor/extracellular signalregulated kinase，FGF/ERK）信号通路

ICM细胞根据内化的时间不同产生了单个细胞之间的异质性，早期内化的细胞表达更高水平的FGF4配体，而后期内化的细胞表现出更高水平的FGF受体1（FGFR1）和FGFR2。分泌的FGF4配体激活表达FGFR1和FGFR2的细胞中的FGF/ERK信号，导致了Gata6基因和Nanog基因在细胞间的差异性表达。表达Gata6基因的细胞最终发育为原始内胚层（primitive endoderm，PE），表达Nanog基因的细胞最终发育为外胚层（epiblast，EPI），即第二次谱系分离[6]。因此，FGF/ERK通路在第二次谱系分离中发挥了重要作用。

脊椎动物的FGF4开始表达于8～16细胞期的桑葚胚，在ICM中仅存在于EPI中，并且表达水平受多能因子OCT4和SOX2的直接调控。相反，其受体FGFR2的表达主要局限于胚胎外谱系，如TE和PE。FGF通过旁分泌的方式作用于FGFR，最终导致ERK通过加速纤维肉瘤（RAF）/丝裂素活化蛋白激酶激酶（MEK)/ERK信号通路活化和核易位，原始内胚层标记基因如Gata6的表达。未接受FGF/ERK信号的细胞则表达Nanog，从而导致了EPI和PE谱系的分离。

研究显示，在ICM形成早期，所有细胞共同表达两个谱系的标记基因Nanog和Gata6，随后这些细胞逐渐上调其中一个因子的表达，同时下调另一个因子的表达，直到两种因子在所有细胞中互斥表达[7-8]。该信号通路的完全阻断会导致所有的ICM细胞变成NANOG阳性的EPI细胞，相反，FGF/ERK通路的过度激活会导致所有的ICM细胞变成GATA6阳性的PE细胞[9-12]。除了在胚胎第二次谱系分离中的作用，FGF/ERK信号是胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）从连续增殖中退出并启动分化所必需的[13]。Kunath等[14]发现FGF4缺失的ESC在未分化状态下表现正常，但经诱导后无法形成神经外胚层和中胚层，添加外源性FGF4因子后其向神经细胞的分化能力恢复。

可见，EPI细胞表达FGF4，FGF4以旁分泌方式作用于PE细胞导致了第二次谱系分离。同时，FGF4又以自分泌的方式驱动EPI细胞退出多能状态，确保胚胎正常分化。因此，为了使ESC具有最佳的增殖能力和多能性，FGF/ERK信号必须控制在一定的阈值以下，相反，在分化过程中，FGF/ERK信号需要被有效激活，以使ESC对谱系诱导产生反应。因此，FGF/ERK信号通路相关分子的表达水平和通路的激活状态对ESC的增殖和分化至关重要。

3 骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信号通路

小鼠囊胚于受精后第4天植入子宫，并伴随着一系列的形态变化形成细长的卵筒结构。在这个转变过程中EPI细胞必须保持其干细胞特性，若在关键阶段干细胞特性受损使胚胎过早分化，可导致胚胎谱系分化紊乱和组织发育缺陷。研究发现，BMP信号通路在维持EPI多能性，防止其向神经组织分化的过程中发挥了重要作用。另外，BMP信号通路在胚胎发育早期背-腹轴的建立中亦发挥重要作用。

BMP属于转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族，在胚胎发育过程中通过保守的BMP/Smad信号通路发挥功能。在小鼠中，虽然已经鉴定出大量的BMP，但只有BMP2和BMP4在早期胚胎发育中起作用，植入后BMP受体1A（BMP receptor 1A，BMPR1A）在EPI中的普遍表达使其成为该时期BMP作用的主要受体。BMP首先与细胞膜上特异的BMPR1和BMPR2结合形成受体复合物，随后活化的BMPR1磷酸化并激活受体调控型Smad蛋白（R-Smad，包括Smad1/5/8），激活后的R-Smad和辅助型Smad蛋白（Co-Smad，包括Smad4）结合形成转录复合物，进入核内与转录因子相互作用调节靶基因的转录[15]。

BMP信号通路在胚胎细胞多能性的维持中有重要作用，虽然BMP信号通路相关分子突变的胚胎能够发育到植入后阶段，但是它们表现出严重的发育异常，不能形成原肠胚，并在受精后第8.5天（embryonic day 8.5，E8.5）左右死亡[16]。Bmpr1a-/-或Bmpr1a突变体胚胎表现为过早分化，多能性基因Oct4、Nanog等表达下调或缺失，早期神经标记基因异位表达，且存在细胞增殖缺陷[17]。BMP信号通路对胚胎背-腹轴的建立亦十分关键，其是重要的腹部细胞命运诱导因子。在囊胚晚期和原肠胚早期，BMP信号下游的活性因子磷酸Smad1/5/8（p-Smad1/5/8），由腹部至背部呈现由高到低的浓度梯度分布，起着形态素的作用[18]。

4 Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路

胚轴的形成又称胚胎极性的确立，是胚胎发育在三维空间上不对称结构的发生过程，也是在发育早期，要求胚胎中每个细胞都能明确其自身相对于其他细胞所处位置的过程。发育过程中形成3个胚轴，即前-后轴、背-腹轴和左-右轴。胚轴一旦形成，每个细胞在胚胎中的位置即可根据胚轴进行准确定义。其中经典Wnt信号通路的激活对胚轴建立的转录调控至关重要。

Wnt信号通路是一个复杂的调控网络，包括经典Wnt信号通路和非经典Wnt信号通路，这里主要介绍由β-catenin介导的经典信号通路。该通路在多种物种间高度保守，其特点为Wnt配体与受体的结合导致细胞质蛋白β-catenin进入细胞核激活靶基因表达，主要参与细胞增殖和迁移等过程。

尽管在植入前的小鼠胚胎中可以检测到多种Wnt配体、受体和相关调节因子，但越来越多的证据表明经典Wnt信号通路对于囊胚形成阶段的胚胎并非必要[19]。但在胚轴的形成过程中Wnt信号通路必不可少，母源Wnt/β-catenin信号通过下游β-catenin诱导了组织中心的形成，建立了胚胎的背-腹轴，βcatenin基因敲除的小鼠胚胎往往在植入后早期死亡，并伴随着前-后轴形成缺陷、中胚层和头部结构的缺失等[20]。Wnt信号在胚胎发育的不同阶段对胚层的诱导作用不同。背部积累的母源β-catenin能激活Nodal信号通路并与之协同作用诱导背部中胚层和内胚层的发育，原肠期合子表达的Wnt信号则促进了胚胎后部、腹部中胚层的形成以及前-后轴线的建立[21-22]，Wnt/β-catenin信号通路还可以通过调控叉头盒j1基因（forkhead box j1，Foxj1）的正常功能在左-右轴的建立方面起作用[23]。可见，Wnt信号通路参与了胚胎早期发育的多重事件，发挥着广泛地调节作用。

5 Notch信号通路

Notch信号通路是一种进化上保守的信号系统，在胚胎细胞谱系分离的多个步骤中控制细胞命运的选择。研究发现，在胚胎发育早期，Notch信号通路在促进TE形成，调节三胚层分化和产生左右不对称性方面发挥了重要作用。

Notch通过配体/受体相互作用激活跨膜Notch受体，导致受体胞内片段（notch intracellular domain，NICD）易位入核，继而调节下游靶基因的表达。研究发现Notch信号通路的关键分子Rbpsuh敲除的胚胎能够发育成囊胚并正常植入，但在原肠胚期死亡，伴随着体细胞生成、神经生成、血管生成和心脏生成方面的严重缺陷，表明在植入前发育过程中Notch信号通路是非必需的，但在胚层分化中必不可少[24]。研究表明，Notch通路的激活可以促进前神经细胞的发育，抑制心肌细胞的分化。在ESC神经诱导第3天短时间激活Notch信号通路，可使细胞周期蛋白D1（cyclinD1）的表达增加，细胞增殖加快，促进神经系统的分化[25-26]。而Notch信号通路激活的细胞早期心脏发育标记基因Brachyury和FGF-8的表达明显降低，不能完成心肌细胞的分化。此外，如前所述，Hippo信号通路的差异性激活和失活导致了第一次谱系分离，最近的研究表明第一次谱系分离是Hippo信号通路和Notch信号通路共同作用的结果，过度激活Notch信号通路可使位于内部的细胞定位到外部进而分化为TE谱系[27]。该研究发现了Notch信号通路在胚胎第一次谱系分化中的作用，为胚胎早期分化的机制研究提供新思路。

6 Nodal信号通路

脊椎动物胚胎发生过程中最重要的事件之一是三个胚层的形成，经过一系列的快速分裂，胚胎在囊胚后期和原肠胚早期形成了中胚层和外胚层。中胚层进一步分化为中胚层和内胚层。最终外胚层发育成皮肤和神经系统，中胚层产生心脏、肌肉、肾脏、骨骼、血管和造血系统，内胚层可分化为消化器官和呼吸器官。中胚层的诱导受到严格的调控，其中Nodal信号通路是中胚层分化最重要的诱导因子。另外，Nodal信号通路还参与了胚层左右不对称发育以及神经的发生与命运决定等诸多过程。

Nodal是TGF-β超家族的一类成员，能与Ⅰ型和Ⅱ型的丝氨酸-苏氨酸激酶受体结合，通过下游的效应分子Smad2/Smad3进一步转导信号，调节目的基因的转录。研究表明，胚胎原结中纤毛的定向摆动引起了Nodal分子向左侧流动，随后Nodal激活中线上Lefty1和侧板中胚层中Lefty2的表达，Lefty1主要起到“屏障”作用，阻断Nodal向右侧扩散，将特异性不对称信号限制在左侧板中胚层，Lefty2在左侧板中胚层中特异性表达，为左右不对称性建立的分子基础[28-30]。此外，Nodal信号分子在不同的浓度对中胚层和内胚层的诱导有不同作用，高浓度时通过激活Mixer和Gata5的表达促进内胚层的发育，低浓度时通过促进FGF配体以及Brachyury的表达诱导中胚层的形成[31-35]。因此，Nodal信号通路功能的正常发挥对胚胎的正常发育有重要意义。

7 结语

胚胎发育是一个极其复杂的过程，不同信号通路既相互作用又功能独特，不同分子按照特定的时空顺序表达和消失是保证胚胎细胞正常增殖和分化的关键，任何一种信号通路都无法单独完成胚胎的发育调控，如Hippo信号通路在ICM中激活，TE中失活，而Notch信号通路在ICM中失活，TE中激活，这种相反的表达模式导致了第一次谱系分离的正常发生[27]。LIF通路和BMP通路的激活共同维持着ESC的多能性和增殖能力，而Nodal和Wnt信号通路的激活启动了ESC的分化，从而使胚胎的增殖和分化协调有序进行[36]。因此，对胚胎发育的研究应充分考虑众多母源因子及复杂信号网络之间的相互调控，这对深入理解不同信号通路间的相互作用具有重要意义。