菌群多样性与巴雷特食管患者病理特征的相关性分析

克拉热·阿合买提 赫晓磊 哈丽达·夏尔甫哈孜 张志强 高鸿亮

新疆医科大学第一附属医院消化二科，新疆乌鲁木齐 830054

Barrett 食管（Barrett’s esophagus，BE）以食管肠化生为主要组织学特征，目前BE 确切的发病率尚未完全明确，据估计其发病率为每年0.2%～2.0%，有1%～2%行上消化内窥镜检查的患者为BE，而有15%的BE 患者可出现胃-食管反流病症状[1-2]。BE 是食管癌前病变，可能进展为食管腺癌，每年每300 例BE 患者中有1 例进展为食管腺癌，而食管腺癌预后不良，大多数患者存活时间不超过5 年[3-4]。目前，胃肠道微生物群已被证明在胃肠道疾病、肠外疾病及各种癌症中起着至关重要的作用[5-6]。最新研究显示[7-10]，胃肠道肿瘤的发生和发展与微生物群通过DNA 损伤、癌基因信号途径的激活、肿瘤诱导代谢物的产生和免疫反应的抑制有关。目前国内针对BE 与食管微生物的相关研究较少，故本研究基于此对BE 患者病理特征与菌群多样性相关性进行分析。现将研究结果报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

将2016 年1 月—2019 年12 月于新疆医科大学第一附属医院（以下简称“我院”）消化科诊治的141 例BE 患者纳入研究，设为BE 组，并纳入138 名同期常规体检人群作为对照组。诊断标准符合《中国巴雷特食管及其早期腺癌筛查与诊治共识（2017 年，万宁）》[11]中BE 的诊断。纳入标准：①经胃镜下组织病理学检查符合BE 诊断；②年龄≥18 岁；③临床资料完整。排除标准：①近3 个月口服质子泵抑制剂治疗＞5 d，近1 个月内使用抗生素、胃肠动力药物及益生菌；②合并幽门螺旋杆菌感染、幽门梗阻及十二指肠梗阻者等；③近1 年行消化道手术等；④合并胃肠道恶性肿瘤；⑤合并严重心、脑、肾等脏器功能衰竭，不能配合病理检查；⑥妊娠期妇女；⑦合并严重感染、自身免疫性疾病；⑧合并严重精神功能异常，不能配合。本研究通过我院医学伦理委员会审核并批准，所有患者均对本研究知情，并签署知情同意。

1.2 方法

所有患者均由经验丰富的内镜室医师进行胃镜检查，镜下留取食管末段活检黏膜样品，置于-80℃环境下备用以进行菌群分析，患者病理检查结果由2 名工作经验在10 年以上的病理科医师共同报告。比较BE 患者与对照组患者食道菌群差异，并根据病理检查结果将患者分为贲门腺型（53 例）、胃底腺型（59例）及特殊肠化生型（29 例），比较患者年龄、性别及病变分化程度等一般资料。采用快速DNA 提取检测试剂盒[天根生化科技（北京有限公司），KG203]对样本菌群的总DNA 进行提取，委托北京诺赛基因组研究中心有限公司进行16S rRNA 测序与菌群鉴定；采用Uparse 软件根据97%序列相似性对所获得的原始序列进行可操作单元（operational taxonomic units，OTU）聚类、获取分类信息；采用线性判别耦合效应分析（linear discriminant analysis coupled with effect sizemeasurements，LEfSe） 进一步探索两组患者食管间差异显著的菌属，采用线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）评估每组物种丰度对差异效果影响的大小，其中LDA 评分＞2 分为菌属差异有统计学意义；采用Mothur 软件对不同分化程度患者食管菌落α 多样性进行分析并比较。

1.3 观察指标

1.3.1 临床资料 比较患者年龄、性别、不典型增生程度及柱状上皮长度。不典型增生程度[12]根据患者病理结果将不典型增生程度分为轻、中、重度，若病变累及上皮下部的l/3，为轻度；若累及超过上皮下部1/3～2/3 处，为中度；若累及上皮全层，为重度。柱状上皮长度[13]根据化生柱状上皮长度分为长节段及短节段，其中化生的柱状上皮长度≥3 cm，累及食管全周者为常节段，化生柱状上皮未累及食管全周，或虽累及全周但长度＜3 cm。

1.3.2 菌群多样性 对患者菌群α 多样性（主要为Chao1、Ace、Simpson 及Shannon 指数）进行分析并比较。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件对所得数据进行统计分析。计数资料以例数或百分比表示，采用χ2检验；计量资料以均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析，两两比较比较采用SNK-q 检验。采用Spearman 模型对患者病变分化程度与菌群多样性的相关性进行分析。以P ＜0.05 为差异统计学意义。

2 结果

2.1 菌群差异分析

LEfse 多级物种差异判别分析显示，在属水平上，BE 组与对照组均有4 个菌属丰度更高；BE 组链球菌属、梭杆菌属、嗜血杆菌属及葡萄球菌属丰度低于对照组（P ＜0.05）；而BE 组弯曲杆菌属、韦荣球菌属、巴氏杆菌属、普雷沃菌属及奈瑟菌属丰度高于对照组（P ＜0.05）。见图1～2。

图1 对照组与巴雷特食管组患者菌群分布层级树图

图2 对照组与巴雷特食管组患者菌种差异分析（LDA 值分布柱状图）

2.2 不同分型患者一般资料比较

不同分型患者不典型增生程度比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）；年龄、性别、柱状上皮长度比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表1。

2.3 不同程度不典型增生患者食道菌群多样性比较

重度组Chao1、Ace 及Shannon 指数明显高于轻度及中度组，且中度组高于轻度组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；而重度组Simpson 指数明显低于轻度及中度组，且中度组低于轻度组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表2。

2.4 巴雷特食管患者不典型增生程度与菌群多样性的相关分析

相关分析显示，Chao1、Ace 及Shannon 指数与患者不典型增生程度呈正相关（r=0.622、0.593、0.588，P ＜0.05），而Simpson 指数与患者不典型增生程度呈负相关（r=-0.582，P ＜0.01）。

表1 不同分型患者一般资料比较（例）

表2 不同程度不典型增生患者食道菌群多样性比较（）

表2 不同程度不典型增生患者食道菌群多样性比较（）

注：与轻度组比较，aP ＜0.05；与中度组比较，bP ＜0.05

3 讨论

食管腺癌是目前常见的消化道疾病，5 年生存率低于20%[14]，研究认为食管腺癌起源于BE，而BE 及BE 进展为食管腺癌的公认危险因素为年龄、男性、肥胖及吸烟等[13,15-16]。目前关于食管失调、炎症及BE 与食管腺癌发病机制间的关系尚不清楚，目前有相关研究认为BE 及食管腺癌与食管微生物群间具有一定联系，既往研究认为食道微生物与口腔微生物群有关，但最新研究认为食道微生物群代表其自身的生态环境[17-20]。

胃肠道的微生物群约占体内代谢物的10%，常见定植菌可协助宿主消化、合成维生素，促进肠道免疫系统的发展，以防止病原体的入侵[21-22]。微生物-肠道间的平衡系由微生物、胃肠道屏障及黏膜免疫系统所共同维持的。若该内环境稳态失衡将会导致固有免疫及适应性免疫反应发生，从而诱发食管炎症[23-24]。

本研究对BE 患者与正常人群食道菌群差异进行比较，结果显示，与正常人群比较，BE 患者食道菌群发生变化，正常人群食道菌群中以革兰阳性菌为主。本研究中对照组人群食管中链球菌属、梭杆菌属、嗜血杆菌属及葡萄球菌属丰度较高；而BE 患者食道则以革兰阴性菌为主，其中弯曲杆菌属、韦荣球菌属、巴氏杆菌属、普雷沃菌属及奈瑟菌属丰度较高。链球菌属是正常食道中最主要的微生物属，BE 患者食道中链球菌丰度则显著下降，而BE 患者食道中丰度较高的弯曲杆菌属可引能会引起食管黏膜慢性炎症，诱导上皮化生，继而可进展发生恶变[5,25]。而BE 患者食道中占优的革兰阴性菌，其外模结构为脂多糖，可通过激活Toll 样受体4、NF-κB 等通路上调促炎细胞因子白细胞介素（IL-6）、IL-8 及IL-1β 等的基因表达，通过参与不同方式的上皮细胞免疫反应，导致慢性炎症，在胃-食管反流病，甚至肿瘤进展方面发挥作用[21,26]。此外，脂多糖表达升高还可通过增加食管下及体内括约肌中iNOS 蛋白及相关mRNA 的表达，从而使食管下括约肌压力下降，增加胃食管反流及食管腺癌的发生风险。

此外，本研究通过对食道不同不典型增生程度与患者菌群多样性进行比较结果显示，不典型增生程度越高患者其食道内菌群多样性越高。与正常食道菌群比较，BE 患者食道内常见定植菌链球菌丰度降低，而其他菌群增加，减少的链球菌可能系由其他菌群作为补偿，而BE 患者食道中新增的菌群，可能系由口腔或胃内菌群移植而来，在BE 发生、发展及肿瘤恶变等过程中起到重要作用。菌群多样性高的患者其BE分化程度越高，提示患者预后欠佳，具有进展成为食管腺癌的风险。

综上，食道菌群变化可能与BE 的发生、发展及恶变相关，而食道菌群多样性与BE 患者食道病变分化程度相关，食道菌群多样性较高的患者其分化程度较高，进展恶变的风险相对较高，预后欠佳。故对患者食道菌群进行干预有可能成为预防及治疗BE 的新靶点。但本研究存在一定不足，首先本研究纳入样本相对较少，分析因素相对单一，故使本研究结果具有一定局限性；食道菌群与患者吸烟、饮食习惯及质子泵抑制等药物的应用相关，但本研究并未对上述因素与菌群间的关系进行进一步探究；本研究并未对BE食管患者食道变化的菌群具体致病机制进行分析，故应进一步行多中心、大样本、多因素的研究对BE 食管患者病理特征与菌群多样性间的关系进行分析。