SCH23390 对吗啡戒断反应和突触素的影响

唐 珊 周圣荃 刘巧凤

成都医学院病理与病理生理学教研室，四川成都 710083

突触素（synaptophysin，SYN）是包裹突触小泡的膜蛋白，是突触活性和突触生长过程中的分子标志物[1]。滥用药物会对神经元的突触连接和功能产生影响，遍及大脑的奖赏回路，包括海马、伏核、腹侧被盖区和中脑导水管灰质区等[2-10]。吗啡依赖大鼠注射纳络酮诱发戒断反应后，中脑导水管灰质区、蓝斑、黑质、豆状核、杏仁核神经细胞的突触在结构上表现为数量增多，并随吗啡依赖时间的延长而明显增加[11]。吗啡成瘾大鼠注射纳络酮引发戒断反应，海马突触密度增加，突触素表达增加[12-13]。自然戒断大鼠，伏核突触密度和数量增加，突触连接面积增加[14]。前期研究发现多巴胺D1 受体拮抗剂SCH23390 降低吗啡戒断反应，但突触可塑性是否在此过程中起作用，还有待研究。因此，本研究将探讨SCH23390 对戒断反应和突触素表达的影响，为临床应用吗啡减轻副作用提供理论基础。

1 对象与方法

1.1 主要试剂

多巴胺D1 受体拮抗剂SCH23390（美国Abcam 公司，批号：ab120597）；多巴胺D1 受体激动剂SKF38393（美国Abcam 公司，批号：120740）；兔抗SYN 单克隆抗体（美国Abcam 公司，批号：ab32127）；鼠抗β-actin单克隆抗体（美国Santa Cruz 公司，批号：sc-47778）；山羊抗鼠或山羊抗兔IgG 二抗（美国Millipore 公司，批号：21538、21537）；盐酸吗啡注射液（沈阳第一制药厂，批号：161015-1）；DAB 染色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：ZLI-9018）；免疫组化试剂盒（北京中杉金桥公司，批号：SAP-9101、SAP-9102）。

1.2 实验动物和分组

8 周龄Wistar 雄性大鼠，体重200～230 g，饲养温度（24±1）℃，购自成都达硕实验动物公司，合格证号SCXK（川）2020-030。实验方案经成都医学院动物实验伦理委员会批准。将40 只大鼠按随机数字表法分为对照组、吗啡组、SCH23390 组和SKF38393 组，每组10 只。吗啡组、SCH23390 组和SKF38393 组大鼠按剂量递增原则，每日8:00 及20:00 腹腔注射吗啡1 次、连续5 d，剂量从10 mg/kg（第1 天起）逐渐增至50 mg/kg（第5 天）。SCH23390 组第1～4 天上午注射吗啡前15 min 中脑导水管灰度区（PAG）核团微量注射0.5 μL 10 mmol/L SCH23390；SKF38393 组PAG 核团微量注射0.5 μL 5 mmol/L SKF38393。对照组腹腔注射等量生理盐水。所有大鼠第5 天注射盐水或吗啡后1 h 腹腔注射纳洛酮（4 mg/kg），观察戒断反应[15-16]。

1.3 戒断反应

记录30 min 内可数症状（如僵直、跳跃、湿狗抖动、摩擦身体、跑或反常姿势）次数，每个症状每出现1 次记1 分。不可数症状（如齿颤、眯眼、腹泻、呵欠、阴茎勃起、眼泪或鼻涕），每5 分钟记录1 次，每个症状每出现1 次记1 分，最高为6 分。体重减少率=（纳络酮注射前体重-注射后1 h 体重）/注射前体重×100%，每减少1%记1 分。全部体征评分总和为该只动物戒断反应总分[17-18]。至实验结束，无动物死亡。

1.4 PAG 埋管

大鼠异氟烷吸入麻醉后固定在立体脑定位仪上，将外径0.6 mm 的不锈钢双套管埋入PAG（AP：-7.6 mm，ML：±0.70 mm，DV：-5.0 mm）[19]，注射针外径0.4 mm超出套管下端1 mm，用牙科水泥固定。

1.5 Western blot 检测

将PAG 核团加入含PMSF、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA 蛋白裂解液，研磨离心收集上清液。按照Bradford 方法测量蛋白浓度[20]。然后进行SDSPAGE 电泳、转膜和封闭。孵育SYN 抗体（1∶300）或β-actin 抗体（1:1000）4℃过夜。次日加二抗孵育。使用Quantity One 软件对结果进行分析。

1.6 免疫组化和阳性细胞计数

常规脱蜡复水，微波抗原修复，山羊血清封闭，滴加1∶100 SYN 抗体4℃过夜。次日孵育二抗37℃20 min，滴加辣根酶复合物37℃15 min，DAB 显色，苏木精复染，常规脱水透明封片。在光学显微镜下，SYN 阳性细胞为圆形或梭形，细胞浆呈棕褐色。每张切片40 倍镜下取PAG 背侧、左上、右上、左下和右下5 个镜野，计数每个镜野阳性细胞总数，取均值。

1.7 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析结合Bonferroni 检验，两两比较采用LSD-t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组大鼠戒断反应行为学比较

吗啡组戒断反应总分及齿颤、腹泻、反常姿势、眯眼、湿狗样抖动评分高于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）。SCH23390 组戒断反应总分、齿颤、腹泻评分低于吗啡组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。SKF38393 组和吗啡组戒断反应总分及齿颤、腹泻、眯眼、湿狗样抖动评分比较，差异无统计意义（P ＞0.05）；而SKF38393 组反常姿势评分高于吗啡组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

表1 四组大鼠戒断反应行为学比较（分，，n=10）

表1 四组大鼠戒断反应行为学比较（分，，n=10）

注：与对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与吗啡组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

2.2 四组大鼠SYN 蛋白和阳性神经元数量比较

吗啡组SYN 蛋白表达水平高于对照组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。SCH23390 组SYN 蛋白表达水平低于吗啡组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。SKF38393 组SYN 蛋白表达水平高于吗啡组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图1、表2。

吗啡组SYN 阳性神经元数量高于对照组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。SCH23390 组SYN 阳性神经元数量低于吗啡组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。SKF38393 组SYN 阳性神经元数量高于吗啡组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表2、图2。

图1 Western blot 检测SYN 蛋白表达情况

表2 四组大鼠SYN 蛋白和阳性神经元数量比较（，n=5）

表2 四组大鼠SYN 蛋白和阳性神经元数量比较（，n=5）

注：与对照组比较，**P ＜0.01；与吗啡组比较，#P ＜0.05。SYN：突触素

3 讨论

吗啡暴露大鼠预先给予SCH23390 治疗后，会降低戒断反应和SYN 表达，相反，多巴胺D1 受体激动剂增加了反常姿势和SYN 表达。体外实验发现，缺失多巴胺D1 受体的细胞培养液，将减少树突棘和SYN表达；反之，增加多巴胺D1 受体的细胞培养液将增加树突棘和SYN 表达[21]。多巴胺D1 受体拮抗剂SCH23390 逆转长期使用成瘾物质引起的突触数量和突触后密度长度增加，并减少突触蛋白的表达[22-23]。多巴胺D1 受体激动剂SKF38393 干预后，在一定程度上减轻神经元超微结构的损坏程度，使突触囊泡较多，突触后致密带增厚[24]。在神经系统疾病中多巴胺D1 受体拮抗剂SCH23390 增加神经元树突棘消亡率[25]。

图2 免疫组化检测SYN 阳性神经元定位和表达（DAB 染色，400×）

综上所述，SCH23390 可能通过降低SYN 抑制吗啡戒断反应，以上发现将为临床应用吗啡减轻副作用提供理论依据。